GB T 21769-2008 化学品.体外3T3中性红摄取光毒性试验方法.pdf

1、ICS 13.300;11.100 A 80 量中华人民共和国国家标准GB/T 21769-2008 化学晶体外3T3中性红摄取光毒性试验方法Chemical-In vitro 3T3 NRU phototoxicity test method 2008-05-12发布2008-09-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局也士中国国家标准化管理委员会a叩GB/T 21769-2008 前本标准等同采用经济合作与发展组织(OECD)化学品测试指南No.432 (2004年)(体外3T3中性红摄取光毒性试验6。阳性对照物的历史数据应当记录。其他光毒性化学物质，若其化学分类或潜解性已被评估过

2、，亦可用于同步阳性对照物替代CPZo5.5 试验步骤5.5. 1 第一天加100L培养基于96孔组织培养板的外围孔(空白对照)，在其余孔中加入100L密度为1X10s个细胞/mL的细胞悬液(=1X104个细胞/孔)。每次试验都应制备两个板，包括相同的受试物浓度序列、溶剂对照和阳性对照。细胞培养24h直至形成半融合单层。在此培养期间细胞恢复活力、贴附和指数增长。5.5.2 第二天去除培养液，用150L孵育缓冲液轻洗两次。加100L含适当浓度受试物或溶剂(溶剂对照)的缓冲液到孔中，受试物设置8个不同浓度，在暗处孵育含受试物的细胞60min。两块培养板随机选择，其中一块用于检测细胞毒性(一Irr),

3、 llP对照板z另一块用于检测光细胞毒性(+Irr)，即处理板。处理板进行+Irr暴露，以无细胞毒性的最高光线剂量(见附录B)透过96孔板盖室温下照射约50 min，在室温下将对照板(-Irr)置于暗盒内50min(=光线暴露时间)。去除试验溶液，用150L孵育用不含受试物的缓冲液小心洗两次。用培养基代替缓冲液孵育过夜(18 h22 h)。5.5.3 第三天5.5.3. 1 显微镜观察相差显微镜察细胞生长情况、形态和细胞单层的完整性，记录细胞形态和生长的变化。5.5.3.2 中性红摄取试验用150L预温的缓冲液冲洗细胞，轻轻敲打去除清洗溶液。加100L含50g/mL中性红元血清的培养基，按照5

4、.2.2孵育3ho 孵育后，吸除中性红培养基，用150L缓冲液清洗细胞。以吸干或离心方式倾倒和去除多余缓冲液，准确加150L中性红洗脱液(用水、乙醇、乙酸按49: 50 : 1的比例现配)。将96孔板置于微量滴定板摇荡器快速震荡10min，直到中性红从细胞中提取出来并形成均匀溶液。用分光光度计在540nm下以空白试剂为参照测量中性红提取物的光密度。试验数据用电子格式保存，便于随后分析。6 试验结果6. 1 试验数据的质量和数量如果受试化学物质的浓度范围内细胞活性下降到50%(lCso) ，那么无论在有光照还是在元光照下6 GB/T 21769-2008 得到的试验数据都应进行有意义的浓度-反应

5、分析。如果发现细胞毒性，不管是整个浓度范围和还是其中任何一个浓度，两者都应符合一条由试验数据拟合成的曲线。对于明显阳性和明显阴性的结果，除此主试验外，再加上一个或多个范围确定试验支撑就足够了，无需做重复试验进行确认。模棱两可的、临界范围附近的和不清楚的结果需要进一步试验进行澄清，在这种情况下，应该考虑改变试验条件。试验条件的改变可能包括浓度范围或间距、预孵育时间、照射暴露时间等。对于水不稳定性化学物缩短暴露时间或许比较合适。6.2 试验结果处理6.2. 1 为评价试验数据，可计算光剌激因子(PIF)或平均光效应(MPE) 6.2.2 为计算光细胞毒性的数值，必须通过适当的连续剂量-反应曲线(模

6、型)对离散的剂量反应值进行约算。对数据进行曲线拟合通常采用非线性的回归方法，为评估数据变异性对拟舍曲线的影响，推荐采用共益程序(或毗带程序bootstrapprocedure)进行分析。6.2.3 预测模型1:光剌激因子(PIF)参考欧盟指令EU67/548/EEC附录VB. 41体外3T3中性红摄取光毒性试验方法，计算PIF值za) 如果在有光照(+Irr)和无光照(-Irr)两种情况下都得到完整的浓度响应曲线，通过式(2)计算PIF值zICso (- Irr) PIF =( 2 ) ICso (十Irr)b) 如果一个化合物只在有光照(+Irr)时有细胞毒性，而在元光照(-Irr)时无细胞

7、毒性，即使试验结果表明其可能具有潜在光毒性，也元法计算PIF。在这种情况下，如果用受试物最高浓度(Cmu;)进行元光照一Irr)下的细胞毒性试验，则可利用Cmu;通过式(3)计算PIF值2C卢(+Irr) PIF= . . ( 3 ) ICso (一Irr)c) 如果受试物在达到允许的最高浓度值也不表现细胞毒性而使得ICso(+ Irr )和ICso(-Irr)的值无法计算，这就表明该受试物无潜在光毒性。这时，用PIF=祷1描述结果，即式(4):Cmu;(一Irr)PIF =赞1.( 4 ) C卢，(+Irr) 在利用式(3)和式(4)计算的情况下，预测受试物的潜在光毒性时应仔细考虑受试物在试

8、验中所达到的浓度回6.2.4 预测模型2:平均光效应(MPE)平均光效应(MPE)是一种基于比较完全浓度反应曲线的计算方法，它的定义是指全部具有代表性的光效应数值的加权平均数。MPE的值通过式(5)计算z.z:; W.PEa MPE=自1.z:;叫.( 5 ) 任何一个浓度(C)的光效应(PEc)是指反应效应(REc)和剂量效应CDEc)的乘积，即PEc=REcXDEc.反应效应(REc)是指无光照和有光照观察到的反应之间的差别，即REc=Rc(-Irr)-Rc (+Irr).剂量反应由式(的得出z1 C/C. -11 DEr一|一一一一一一|. . . . ( 6 ) 1 C/C. + 11

9、 其中c代表等值浓度，即撤度为C的一I反应相当于+Irr时反应的浓度，如果由于+Irr曲线中GB/T 21769-2008 的反应值整体高于或低于Rc(-Irr)而使C不能得出，则剂量效应定为1。加权因子W;由最高反应值得出，即W;=MAXR;(+Irr)，R;(-Irr).格子浓度G指选择落在由试验浓度的值确定的每个浓度间隔内的相同数量的点。MPE的计算严格局限于最高浓度下的两条曲线中，至少有一条曲线的反应值仍出现至少10%的情况。如果这一最高浓度高于+Irr试验中的最高浓度，则+Irr的残余部分设定为反应值0。依据MPE的值是否大于正常选择设定的临界值(MPEc=O.15)，对化学物质进行

10、光毒性分类，6.2.5 计算PIF和MPE的软件包可从OECD官方网站获得.6.3 结果解释6.3. 1 由预测模型得出的数值，如果z受试物PIF0.15，预测光毒性。但是在利用预测模型PIF的情况下z如果仅得到一个PIF，那么任何大于1的值均表明受试物具有潜在光毒性;如果仅得到一个PIF=祷1，则受试物无潜在光毒性。6.3.2 对于任何一间实验室最初建立这一检测方法，应在进行受试物光毒性检测前应先用列于表1的参考物质进行试验，试验得到的PIF值和MPE值应接近于表1中所列数值。表1参考物质的光毒性测定鼓据化学物名称和CAS编号PIF MPE 吸收峰溶剂盐酸胶硕翻Amiodarone 242

11、nm HCL 19774-82-4J 3.25 0.27-0.54 乙醇300 nm(肩峰)盐酸氯丙嚓Chloropromazine HCL 69-09-0J 14.4 0.33-0.63 309 nm 乙蹲诺氟沙星Norfloxacin 70458-阳市7J71. 6 0.34-0.90 316 nm 乙脯惠Anthracene120-12-7J 18.5 0.19-0.81 356 nm 乙脯原日卡琳Protoporphyrin lX, Disodium 50865-01-5J 45.3 0.54-0.74 402 nm 乙醇组氨酸L - Histidine 7006-35-1J no P

12、IF 0.05-0.10 211 nm 水299 nm 六氯MHexachlorophene 70-30-4J 1. 1-1. 7 0.00-0.05 乙醇317 nm(肩峰)十二烧基硫酸锅Sodium lauryl sulfate口51-21-3J1. 0-1. 9 0.00-0.05 无吸收水6.3.3 数据说明如果光毒性效应只在最高试验浓度(特别是水溶性受试物时获得，要评价此受试物的危害性可能还需做进一步考虑，包括受试物皮肤吸收性和累积的可能性，或进行其他试验，如化学物质的体外动物皮肤、人类皮肤或皮肤模型的检测。体外3T3中性红摄取光毒性试验得到的阴性结果(PIF5或MPEO.l)表明受

13、试物在试验所用的培养条件下对培养的哺乳动物细胞元光毒性。如果没有毒性被证实(+Irr和一Irr)，或者由于受试物的低溶解性使受试物的试验浓度受到限制，那么受试物与检测方法的兼容性可能值得怀疑，应采用其他模型进行确认试验。7 试验报告7. 1 试验报告必须包含以下信息7. 1. 1 曼试物证明材料，统一名称，IUPAC和CAS编码(如果已知); 一一物理性质和纯度z一一与试验相关的物理化学特性FUV /vis吸收光谱;一一稳定性和光稳定性(如果已知)。7. 1. 2 溶剂溶剂选择的理由;一受试物在溶剂中的潜解性z-一处理培养基中溶剂的百分比。7. 1. 3 细胞细胞类型和来源z一一元支原体资料z

14、一细胞传代数(如果已知); 一一细胞的光线敏感度，用光毒性试验中相同的光照设备测定。7. 1.4 试验条件。):处理前后的孵育培养基的类型和组成z一孵育条件(C02浓度，温度，湿度); 一一孵育时闰(处理前，处理后。7. 1. 5 试验条件(2):用曼试物处理有光照和元光照条件下，选择受试物浓度的理由F受试物溶解度有限而且无细胞毒性的情况下，最高浓度试验的理由;处理培养基的类型和组成缓冲盐溶液); 一-化学物处理持续时间。7. 1. 6 试验条件(3):光照一一所用光源选择的理由p光源和照度计的制造商和类型;一一-光源的发光光谱特性z一一所用的滤光器的发射和吸收特性;熙、度计的特性及其校准的详

15、细资料z光源与试验系统的距离z一一在此距离内的UVA辐照度，以mW/cm2表示自一一暴露于UV/vis下的持续时间;UVA 剂量(辐照度时间)，以J/cm2表示s一一光照期间细胞培养的温度和同时放置在暗处的细胞培养温度。7. 1. 7 试验条件(4):中性红活性试验一一一中性红处理培养基的组成z一一中性红孵育时间z一一培养条件(C02，温度，湿度); 一中性红提取的条件(提取剂，时间); GB/T 21769-2008 9 GB/T 21769-2008 一一用于读取中性红光密度的分光光度计的波长3一一第二波长(参考)，如果使用;一一分光光度计空白的容量，如果使用。7. 1.8 结果一一每个受

16、试物浓度得到的细胞活性，以平均活性百分率表示，同时测定溶剂对照z一一同时进行的+Irr和一lrr试验中获得的浓度反应曲线受试物浓度对相对细胞活性); 一一浓度-反应曲线的数据分析，可能的话，列出电脑或人工计算ICso(+ lrr)和ICso(一Irr)的方法;一一比较在有光照和元光照下获得的两个浓度反应曲线，通过PIF或通过MPE计算zm一一试验接受标准z同时进行榕剂对照p一一有光照和无光照条件下细胞绝对活性(NR提取物的光密度); 一一阴性和溶剂对照的历史数据，平均值和标准偏差5一一试验接受标准z同时进行的阳性对照;一一阳性对照化学物的ICso(十lrr)和ICso( - lrr) ，PIF

17、或MPE;一一阳性对照化学物的历史实验数据:ICso (+ Irr) , ICso (-lrr)、PIF和MPE，平均值和标准偏差。7.2 结果讨论7.3 结论10 G/T 21769-2008 附录A(资料性附录)3T3 NRU光毒性试验在化学晶光毒性连续试验中的作用A.1 3T3 NRU光毒性试验在化学品光毒性连续试验中的作用，见图A.10 受试物物理、化学和毒理学特性的初步评价一一物理化学特性一-也学结构，结构警示一-uv/vis-吸收一-QSAR-光化学一一一般毒性包括毒性动力学和代谢)体外3T3NRU光毒性试验必要时同时进行或选择其他方法考虑不必进行光毒性试验固A.13T3 NRU光

18、毒性试验在化学晶光毒性连续试验中的作用11 GB/T 21769-2008 附录B(资料性附录)光模拟器的谱能和细胞的敏感性光模拟器谱能分布图B.l显示一个可接受的经滤过的光模拟器的光谱能量分布，资料来源于3T3NRU光毒性验证试验中(掺杂)金属卤化物灯。分别显示两个不同滤光片和96孔培养板盖的滤过效果。H2滤光片仅用于能耐受高剂量UVB的试验系统(如皮肤模型试验和红细胞光溶血性试验。在3T3NRU光毒性试验中应使用Hl滤光片。图B.l显示培养板盖的滤过作用主要见于UVB区域，辐射光谱中仍残留足够量的UVB足以激活类似胶腆酣的化学物质，它们在UVB区域具有典型的光吸收作用。B.1 100 可见

19、光A m UVB 10 0.1 0.01 PEQPEV倒回国事700 650 600 550 500 450 350 300 0.001 250 波长/nm混过的光模拟器的光谱能量圄B.1细胞的光照敏感性(UVA范围内测定)图B.2显示Balb/c3T3细胞对光模拟器发射光线的敏感性，资料来源于3T3NRU光毒性验证试验，数据在UVA范围内测定。图示在预验证研究中7个不同的实验室得到的数据。两条空心标志的曲线来自衰老的细胞(超次数传代)，必须更新细胞才能用于试验。标记实心符号的曲线表示可接受的光照耐受水平。从这些数据得出最高的无细胞毒性照射剂量为5J/cm2 (垂直虚线)，水平虚线显示最高可接

20、受的照射效应，见5.4.2.12 B.2 GB/T 21769-2008 5 J/cm2 120 80 60 40 20 100 法僻山崎悖理事200 150 100 辐射时间/min(10 min1 J/cnt) 50 。13 Balb/c 3口细胞的光照敏感性(在UVA范围内测定)圄B.2CON-ghFNH筒。华人民共和国家标准化学晶体外3四中性虹摄取光毒性试验方法GB/T 21769-2008 国中 中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 印张1.25 字数25千字2008年7月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2008年7月第一版* 书号:155066 1-32202 如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533