GB T 4789.38-2008 食品卫生微生物学检验 大肠杆菌计数.pdf

1、ICS 0710030C 53 a园中华人民共和国国家标准GBT 478938200820081 121发布食品卫生微生物学检验大肠杆菌计数Microbiological examination of food hygiene-Enumeration of Escherichia coli2009-03-0 1实施丰瀚熬篓发布中国国家标准化管理委员会仪1”刚 置GBT 4789382008本标准的第一法和第二法修改采用美国食品药品管理局(FDA)细菌学分析手册第4章大肠杆菌和大肠菌群计数(2002年)(Bacteri0109lcal Analytical Manual，Chapter 4：En

2、umeration of Escherichia coli and the coliform bacteria，2002)，第三法修改采用国际分析家学会(AOAC INTERNATIONAL)AOAC 99114食品中大肠菌群和大肠杆菌计数Petrifilm测试片法(1994年)(AOAC OfficialMethod 99114，Coliform and Escherichia(oli counts in foods Dry rehydratable film Petrifilm Fcolicount plate and Petrifilm coliform count platemetho

3、ds，1994)和AOAC 99808禽、肉和水产品中大肠杆菌计数(1998年)(AOAC Official Method 99808，Comfirmed Escherichia coli in poultry，meatsand seafood-Dry rehydratable film method Petrifilm Ecoli count plate，1998)。本标准的第一法和第二法与FDA方法的主要区别是：一一将样品制备时取样量50 g(或50 mI，)修改为25 g(或25 rnL)；将培养温度351修改为361；将EC培养温度45502(一般食品)和4450，2(贝类)统一为44

4、5土02。本标准的第三法与AOAC方法的主要区别是：将样品制备时取样50 g(或50 mL)修改为25 g(或25 mI。)；将培养温度351修改为361。本标准的附录A、附录B为规范性附录。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准由中华人民共和国卫生部负责解释。本标准负责起草单位：中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准参与起草单位：中华人民共和国内蒙古出入境检验检疫局、江苏省疾病预防控制中心、上海市疾病预防控制中心、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人：刘秀梅、刘中学、袁宝君、刘弘、陈敏、卢行安、田静。1范围食品卫生微生物学检验大肠杆菌计数本标准规定了食品中大肠杆

5、菌计数的方法。本标准适用于各类食品中大肠杆菌的计数，其中第二法不适用于贝类产品。2术语和定义GBT 4789382008下列术语和定义适用于本标准。21大肠杆菌Escherichia coli广泛存在于人和温血动物的肠道中，能够在445发酵乳糖产酸产气，IMViC(靛基质、甲基红、VP试验、柠檬酸盐)生化试验为+ 或一+一一的革兰氏阴性杆菌。以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性。22最可能数most probable number；MPN基于泊松分布的一种间接计数方法。3设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：31恒温培养箱：36

6、1。32冰箱：25。33恒温水浴箱：44502。34天平：感量01 g。35均质器。36振荡器。37无菌吸管：1 mL(具001 mI。刻度)、10 mL(具01 mL刻度)或微量移液器及吸头。38无菌锥形瓶：容量500 mL。39无菌培养皿：直径90 mm。310 pH计或pH比色管或精密pH试纸。31 1 菌落计数器或Petritilm“”自动判读仪。312紫外灯：波长360 nm366 nm，功率6 w。4培养基和试剂41 月桂基磺酸盐胰蛋白胨(1auryI sulfate tryptose，LST)肉汤：见第A1章。42 EC肉汤(Ecoli broth)：见第A2章。43蛋白胨水：见

7、第A3章。44缓冲葡萄糖蛋白胨水(MR VP实验用)：见第A4章。45 Korser柠檬酸盐肉汤：见第A5章。1)PetrifilmTM是由3M公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。1GBT 478938200846磷酸盐缓冲液：见第A6章。47伊红美蓝(eosin methylene blue，EMB)琼脂：见第A7章。48营养琼脂斜面：见第A8章。49结晶紫中性红胆盐(violet red bile，VRB)琼脂：见第A9章。410 VRBMUG琼脂：见第A10章。411革兰氏染色液：见

8、第A11章。412 Kovacs靛基质试剂：见第A12章。413甲基红指示剂：见第A13章。414 Voges pros kauer(V P)试剂：见第A14章。415无菌生理盐水：称取85 g氯化钠溶于1 000 mI。蒸馏水中，121高压灭菌15 min。416 l molI。氢氧化钠(NaOH)：称取40 g氢氧化钠溶于1 000 mL蒸馏水中。417 1 toolI盐酸(HCl)：移取浓盐酸90 mI。，用蒸馏水稀释至1 000 mI。418 Petrifilm大肠菌群大肠杆菌检验测试片。5检验程序见图1。第一法大肠杆菌MPN计数图1大肠杆菌MPN计数法检验程序GBT 47893820

9、086操作步骤61样品的稀释611 固体和半固体样品：以无菌操作取25 g样品，置盛有225 mI磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内，8 000 rmin10 000 rrain均质1 min2 min，制成1：10样品匀液，或置盛有225 mL磷酸盐缓冲液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min2 rain制成1：10的样品匀液。612液体样品：以无菌吸管吸取样品25 mI置盛有225 mL磷酸盐缓冲液的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的玻璃珠)中，充分振摇，制成】：10的样品匀液。613样品匀液的pH值应在6575之间，必要时分别用1 molI。氢氧化钠(NaOH)或1 molI盐酸(HCI)调节

10、。614用】mI。无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1 mL，沿管壁徐徐注入盛有9 mL磷酸盐缓冲液的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面)，振摇试管或换用1支l mI。无菌吸管或吸头反复吹打，使其混合均匀，制成1：100的样品匀液。615根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1 mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过1 5 min。62初发酵试验每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液)。每个稀释度接种3管月桂基磺酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤，每管接种1 ml。(如接种量

11、超过1 mI，则用双料LST肉汤)。361培养24 h2 h，观察小倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48 h2 h。记录在24 h48 h内产气的LST肉汤管数。如所有LST肉汤管均未产气，即可报告大肠杆菌MPN结果；如有产气者，则进行复发酵试验。63复发酵试验用接种环分别从所有培养48 h：L 2 h内发酵产气的LST肉汤管中取培养物1环，移种于已提前预温至45的EC肉汤管中，放人带盖的44502水浴箱内。水浴的水面应高于肉汤培养基液面，培养24 h2 h，检查小倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48 h2 h。记录在24 h和48 h内产气的EC肉汤管数。如所有EC肉汤管

12、均未产气，即可报告大肠杆菌MPN结果；如有产气者，则进行EMB平板分离培养。64伊红美蓝平板分离培养轻轻振摇各产气管，用接种环取培养物划线分别接种于EMB平板，36l培养18 h24 h。检验平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。65营养琼脂斜面或平板培养从每个平板上挑5个典型菌落，如无典型菌落则挑取可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面或平板上，36l，培养18 h24 h。取培养物进行革兰氏染色和生化试验。66生化试验661靛基质试验：将培养物接种蛋白胨水，361培养24 h4-2 h后，加Kovaes靛基质试剂02 mIO3 mI。，上层出现红色为靛基质阳性反应。

13、662 MR VP试验：将培养物接种MRVP培养基，361培养48 h2 h。移取培养物1 mL至13 131111100 mm试管中，加5d萘酚乙醇溶液06 mI。40氢氧化钾溶液02 mI。和少许肌酸结晶，振摇试管后静置2 h，如出现伊红色，为vP试验阳性。将MR vP培养液的剩余部分再培养48 h后滴加5滴甲基红指示剂。培养物变红色，为甲基红试验阳性，若变黄色则为阴性反应。663柠檬酸盐利用试验：将培养物接种Koser氏柠檬酸盐肉汤，361培养96 h2 h，记录有无细菌生长。3GBT 4789382008大肠杆菌与非大肠杆菌的生化鉴别见表1。表1 大肠杆菌与非大肠杆菌的生化鉴别靛基质(

14、I) 甲基红(MR) VP试验(VP) 柠檬酸盐(c) 鉴定(型别)上 上 典型大肠杆菌+ 非典型大肠杆菌+ + 上 典型中间型一 + + 非典型中间型上 上 典型产气肠杆菌+ 上 + 非典型产气肠杆菌注1：如出现表1以外的生化反应类型，表明培养物可能不纯应重新划线分离，必要时做重复试验。注2：生化试验也可以选用VITEK GNI鉴定卡、API 20E等方法，按照产品说明书进行操作。67大肠杆菌MPN计数的报告大肠杆菌为革兰氏阴性无芽胞杆菌，发酵乳糖、产酸、产气，IMViC生化试验为+ 一或一+一。只要有1个菌落鉴定为大肠杆菌，其所代表的LST肉汤管即为大肠杆菌阳性。依据LST肉汤阳性管数查M

15、PN表(见附录B)，报告每克(或毫升)样品中大肠杆菌MPN值。第二法 大肠杆菌VRBMUG平板计数法7检验程序见图2。8样品稀释按61进行。检样25 g(或25 mL)样品+225 mL稀释液，均质10倍系列稀释l 选择2个3个适宜连续稀释度的样品匀液，接种VRB-MUG平板361 18 h24 h紫外灯照射，计数发荧光菌落报告结果图2大肠杆菌VRBMUG平板计数法检验程序GBT 478938-20089检验选取2个3个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度分别取l mL注入两个无菌平皿。另取1 mL稀释液注入一个无菌平皿中，作空白对照。将4505的VRB琼脂10 mL15 ml，倾注于每个平

16、皿中。小心旋转平皿，将培养基与样品匀液充分混匀。待琼脂凝固后，再加3 mL4mL VRBMUG琼脂覆盖平板表层。凝固后翻转平板，361培养18 h24 h。选择菌落数为10100的平板，暗室中360 nm366 nm波长紫外灯照射下，计数平板上发浅蓝色荧光的菌落。检验时用已知MUG阳性菌株(如大肠杆菌ATCC 25922)和产气肠杆菌(如ATCC 13048)敞阳性和阴性对照。10大肠杆菌平板计数的报告两个平板上发荧光菌落数的平均数乘以稀释倍数，报告每克(或毫升)样品中大肠杆菌数，以CFUg(CFUmL)表示。第三法 大肠杆菌Petrifilm“测试片计数法11检验程序见图3。12样品稀释按6

17、1进行。13检验检样25 g(或25 mL)样品-225 ml。稀释液，均质10倍系列稀释选择适宜2个3个连续稀释度的样品匀液，接种PetrifilmTM测试361 24 h2 h或48 h2 h计数Petnnlm测试片上的蓝色带气泡菌报告结果图3大肠杆菌PetrifilmTM测试片计数法检验程序131接种和培养选取2个3个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种两张测试片。将测试片置于平坦实验台面，揭开上层膜，用吸管吸取样品匀液1 mL垂直滴加在测试片的中央，将上层膜缓慢盖下，避免5GBT 4789382008气泡产生和上层膜直接落下，将压板(平面底朝下)放置在上层膜中央处，轻轻地压下，使

18、样品匀液均匀覆盖于圆形的培养膜表面，切勿扭转压板。拿起压板，静置至少1 rain以使培养基凝固。将测试片的透明面朝上置于培养箱内，堆叠片数不超过20片，361培养。肉、家禽和水产品，培养时间为24 h2 h；其他食品，培养时间为48 h2 h。132判读可肉眼观察计数，或用菌落计数器、放大镜、Petrifilm”自动判读仪计数。蓝色有气泡的菌落确认为大肠杆菌，不论蓝色的深浅，部分蓝色的带气泡菌落也判定为大肠杆菌。圆形培养膜边缘及边缘以外的菌落不计数。当测试片出现大量气泡、不明显的小菌落，培养区呈蓝色时，需要进一步稀释样品匀液重新检验。14大肠杆菌测试片计数的报告选择菌落数在1 5150之间的稀

19、释度，两张测试片菌落平均数乘以稀释倍数，即为每克(或毫升)样品中大肠杆菌数，以CFUg(cFUmI。)表示。如果所有稀释度测试片上的菌落数都小于1 5，计数最低稀释度测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告；如果所有稀释度的测试片上均无菌落生长，以“小于1乘以最低稀释倍数”报告；如果所有稀释度的菌落数都大于150，计数最高稀释度测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告。计数菌落数大于1 50个的测试片时，可计数一个或两个具有代表性的方格内的菌落数，换算成单个方格内的菌落数后乘以20，即为测试片上估算的菌落数(圆形生长面积为20 CFll2)。A1 月桂基磺酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤A11成分胰蛋白胨或

20、胰酪胨氯化钠乳糖磷酸氢二钾(KzHPOa)磷酸二氢钾(KH。POt)月桂基硫酸钠蒸馏水pH6802A12制法将上述成分溶解于蒸馏水中，调节pH。灭菌15 rain。附录A(规范性附录)培养基和试剂200 g50 g50 g275 g275 g01 g1 000 mLGBT 478938-2008分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10 mL。1 21高压制备双料LST肉汤时，除蒸馏水外其他成分加倍。A2 EC肉汤A21成分胰蛋白胨或胰酪胨3号胆盐或混合胆盐乳糖磷酸氢二钾(Kz HPO，)磷酸二氢钾(KH。PO。)氯化钠蒸馏水pH694-01A22制法200 g15 g50 g40 g15 g50

21、g】0000mI，将上述成分溶解于蒸馏水中，调节pH，分装于有倒立小发酵管的试管中，每管8 mI。1 21高压灭菌1 5 min。A3蛋自胨水A31成分胰胨或胰酪胨蒸馏水pH6902A32制法100 g1 0000 rflL加热搅拌溶解胰胨或胰酪胨于蒸馏水中。分装试管，每管5 mL。121高压灭菌15 rain。GBT 478938-2008A4缓冲葡萄糖蛋白胨水(MR-VP实验用)A41成分多胨 70 g葡萄糖 50 g磷酸氢二钾(KzHPO。) 50 g蒸馏水 1 0000mI。pH69-4-02A42制法将上述成分溶于蒸馏水中，调节pH，分装试管，121高压灭菌15 rain。A5 Ko

22、rser氏柠檬酸盐肉汤A51成分磷酸氢铵钠(NaNH。HP044H20) 15 g磷酸氢二钾(KzHPO。) 10 g硫酸镁(MgS047H20)02 g柠檬酸钠(含2H20) 30 g蒸馏水 1 0000 mLpH67土02A52制法将上述成分溶解于蒸馏水中，调节pH，分装试管，每管10 mL，121高压灭菌15 min。A6磷酸盐缓冲液A61成分磷酸二氢钾(KH。PO。)蒸馏水pH72A62制法340 g500mI。贮存液：称取340 g的磷酸二氢钾溶于500 mL蒸馏水中，用大约175 mL的1 molL氢氧化钠溶液调节pH至72，用蒸馏水稀释至1 000 mL后贮存于冰箱。稀释液：取贮

23、存液125 mL，用蒸馏水稀释至1 000 mI。，分装于适宜容器中，121高压灭菌15 rain。A7 伊红美蓝琼脂(EMB)A71成分蛋白胨 100 g乳糖 100 g磷酸氢二钾(K。HPO。) 20 g琼脂 1 50 g伊红7(水溶液)04 g或2水溶液20mL美蓝0065 g或05水溶液1 3 mI。蒸馏水 1 0000mI。pH 71028GBT 4789382008A72制法在1 000 mI蒸馏水中煮沸溶解蛋白胨、磷酸盐和琼脂，加水补足。分装于三角烧瓶中。每瓶100 m1或200 mL，调节pH，高压灭菌。使用前将琼脂融化，于每100 mL琼脂中加5 mL灭菌的20乳糖溶液，2

24、mI，的2的伊红7水溶液和13 mL 05的美蓝水溶液，摇匀，冷至4550倾注平皿。A8营养琼脂斜面A81成分牛肉膏蛋白胨琼脂蒸馏水pH7301A82制法将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解摆成斜面备用。A9结晶紫中性红胆盐(VRB)琼脂A91成分蛋白胨酵母膏乳糖氯化钠胆盐或3号胆盐中性红结晶紫琼脂蒸馏水pH7401A92制法30 g50 g150 g1 0000mI，调节pH。分装合适的试管，121高压灭菌15 min。灭菌后70 g30 g100 g50 g15 g003 g0002 g15 g18 g1 0000mL将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调节pH。煮沸2 rain，将

25、培养基冷至4550倾注平板。临用时制备，不得超过3 h。A10 VRBMUG琼脂A101成分蛋白胨 70 g酵母膏 30 g乳糖 100 g氯化钠 50 g胆盐或3号胆盐 15 g中性红003 g结晶紫0002 g琼脂 15 g18 gGBT 4789382008蒸馏水 1 0000mI一4一甲基伞形酮一口D-葡萄糖苷(MUG)01 gpH7401A102制法将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调节pH。煮沸2 min，冷却至4550使用。A11革兰氏染色液A111结晶紫染色液A1111成分结晶紫 10 g95乙醇 200 mI。l草酸铵水溶液800 mLA1112制法将结晶紫完全溶

26、解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。A112革兰氏碘液A1121成分碘 10 g碘化钾 20 g蒸馏水 3000 mI，A1122制法将碘与碘化钾先行混合，加入蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300 mI。A113沙黄复染液A1131成分沙黄025 g95乙醇 100 mL蒸馏水 900mLA1132制法将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。A114染色法A1141 涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染l min，水洗。A1142滴加革兰氏碘液，作用1 nan，水洗。A1143滴加95乙醇脱色约1 5 s30 S，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。A1144滴加复染液，复染1

27、min，水洗、待干、镜检。A12 Kovacs靛基质试剂A121成分对二甲氨基苯甲醛 50 g戊醇 750ml。盐酸(浓) 250 mI，A122制法将对二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中，然后慢慢加入浓盐酸即可。1 nA13甲基红指示剂A131成分甲基红95乙醇A132制法01 g300mI将甲基红溶解于300 mL乙醇中，加水稀释至500 mL。A1 4 Voges-Pros kauer(VP)试剂甲液：a一萘酚 50 g无水乙醇 1000 mL乙液：氢氧化钾400 g用蒸馏水加至 1000 mI。GnT 478938-2008GBT 4789382008附录B(规范性附录)大肠杆菌最可能数(MPN

28、)检索表每克(或毫升)检样中大肠杆菌最可能数(MPN)的检索见表B1。表B1 大肠杆菌最可能数(MPN)检索表阳性管数 95置信区间 阳性管数 95置信区间MPN MPNo10 o 01 o001 下限 上限 o10 o 01 o 001 下限 上限o o o 1 100 420 注1：本表采用3个稀释度o 1 g(或o l rnI。)、001 g(或0 0I mi，)和0OOl g(或0 001 mL)，每个稀释度接种3管。注2：表内所列检样量如改用1 g(或1 mL)、0 1 g(或01 ml。)和0 01 g(或001 mI。)时，表内数字应相应降低lO倍；如改用o01 g(或O01 ml。)、O 001 g(或o001 rnl。)、o000 1 g(或O000 1 ml，)时，则表内数字应相应增高10倍，其余类推。