GB T 18634-2002 饲用植酸酶活性的测定 分光光度法.pdf

1、G/T 18634-2002 前司本标准参考美国公职分析化学家协会CAOAC)方法和国外有关文献资料制定。本标准确定了饲用植酸酶的活性单位定义，采用饥铝显色分光光度法测定植酸酶活性。此项标准分为绝对法和相对法，对标准物质和试剂的选择均有详细说明。规定了方法的适用范围.检测原理，检测l程序及最佳样品浓度。本标准的附录A是提示的附录。本标准由全国饲料:业标准化技术委员会提出并归口。本标准起草单位z国家饲料质量监督检验中心(北京人罗氏泰山(1-.海)维生素制品有限公司、巴斯夫维生素有限公司。本标准主要起草人.马东霞、苏晓鸥、张苏、王云金、张若寒。2j j 1 范围中华人民共和国国家标准饲用植酸酶活性

2、的测定分光光度法Determination of reed phytase activity Spectrothotometric method 本标准规定了以分光光度法测定饲用植酸酶活性的方法。GB/T 18634 _. 2002 本标准适用于作饲料添加剂用的植酸酶产品，也适用于添加有植酸酶的配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料。样品最低检出量为90U/kgo 2 引用标准下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB/T 6682一1992分析实验室用水规格和试验方法

3、(neqISO 3696: 1987) 3 檀隘酶活性单位定义样品在植酸饷浓度为5.0mmol/L、温度37C、pH值5.50的条件下，每分钟从植酸纳中释放lmol元机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。4 方法原理植酸酶在一定温度和pH条件下，水解底物植酸俐，生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性溶液中，用饥锢酸镀处理会生成黄色的(NH，)，PO.NH.VO， 16MoO，J复合物，在波长415nm下进行比色测定。5 试剂和溶液本标准中所用试剂，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和符合GB/T6682中规定的三级水。清洗试验用容器不要用含磷清洗剂。5. 1 乙酸缓冲液(J ) .c(CH,COO

4、Na 3H20)为0.25mol/L:称取34.02日三水乙酸钩.O. 1 g吐温20于1000 mL容量瓶中，加入900mL水溶解，用盐酸调节pH至5.50土O.01.并用蒸馆水定容至1 000 mL.室温下存放2个月有效。5. 2 乙酸缓冲液(I J .c(CH,COONa 3H，O)为O.25 mol/L:称取34.02 g三水乙酸纳.5日吐温20.30 g乙二胶四乙酸二纳(EDTAJ于1000mL容量瓶中，加入900mL水溶解，用盐酸调节pH至5.50土0.01.并用蒸馆水定容至1000mL.室温下存放2个月有效。5. 3 植酸纳溶液，以C.H，OPr，NaIZ)为7.5mmol/L:

5、称取O.692 9 g肌醇六磷酸饷(CH，OP，Na川于100 mL容量瓶中，用乙酸缓冲液(5.1 )溶解并定容至刻度，现用现配(实际反应液中的最终浓度为5.0 mmol/LJ。中华人民共和国国家质量监督检验检瘦总局2002-02-19批准2002 - 07 -01实施2 l.t GB/T 18634一20025. 4 硝酸溶液1+2水烧液。5.5 100 g/L锢酸镀溶液称取10g锢酸镀(NH)Mo，O 4H，OJ于100mL容量瓶巾.加入1.0mL 氨水(25%)用水溶解定容至刻度。5.62.35日/L饥酸镀潜液:称取O.235 g饥酸镀(NH，VO，)于100mL棕色容量瓶中，加人2mL

6、硝酸浴液(S.4) ，用水溶解定容至刻度。避光条件下保存周有效。5. 7 颜色终止液:移取2份硝酸溶液(5.4)，1份锢酸镀溶液(5.日，1份饥酸镀溶液(5.6)混合后使用，现用现配。5.8 植酸酶标准品(标明准确活性单位和类型)。5.9 磷酸二氢饵(KH2PO，)，基准物。6 仪器和设备6. 1 实验室常用仪器设备。6.2 恒温水浴，(37士O.1) C 0 6. 3 分Jt光度计2有10mm比色皿，可在415nm下测定吸光度。6. 4 俄力搅拌器。6. 5 涡流式混合器。6. 6 酸度计:精确至小数点后2位。6. 7 离心机:转速为4000 r/min以上。7 试样制备取有代表性:样品，用

7、四分法将试样缩分至200g，植酸酶产品不需粉碎，配合饲料和添加剂预混合饲料需粉碎通过0.45mm标准筛，装入密封容器，防止试样成分变化。8 测定步骤8 1 绝对法(仲裁法)8 1. 1 标准曲线l1t确称取O.680 4且在105C烘至恒重的基准磷酸二氢惆(5.9)于100mL容量瓶中，用乙酸缓冲液(5. 1)溶解，并定容至100mL，浓度为50.0mmol/L。按表1的比例稀释成不同浓度，与试样-起反应测定，以无机磷浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，列出直线回归方程(y=ax+b)。表1标准序号稀择量/mL浓度/(mmol/Ll1 O. 5 l 25 2 O. 5 2 12. 5 3 Q. 5

8、4 6. 25 4 O. 5 8 3. 125 5 0.5-16 1. 562 5 8. 1. 2 试样溶液的制备按照附录A中建议的称样量称取试样两份，精确至O.000 1 g，置于100mL容量瓶中.加入约70 ml.乙酸缓冲液(5.1)，一个俄力棒，在磁力搅拌器(6.4)上高速搅拌30min.用乙酸缓冲液(5.1 )定容至刻度(减去磁力棒的体积)。摇匀，在离心机(6.7)上以4000 r/min离心10min 0分取不同体积的土洁液用乙酸缓冲液(5. 1)稀释，使样液浓度保持在Q.4U/mL左右，待反应。)添加IillJ 负混合饲料样品需采用乙酸缓冲液(5.2)，391 G/T 18634

9、.2002 建议在测定样品时附加个已知活性的植酸酶参考样，便于检验赘个操作过程是否有偏羔08. 1. 3 反应J!j( 10 mL试管按下面的反应顺序进行操作，在反应过程巾，从加入底物(5.3)开始，向每支试管中加入试剂的时间间隔要绝对一致，37C水解30miD 0 反应步骤及试剂、溶液用量见表2。表2反应顺序样品、标准 样品空白标准空白)l 加乙酸缓冲液(5.1或5.2) 1.8 mL 1.8 mL(Z. 0 mL) 2力11人待反哑搜0.2 mL 0.2 mL 3. /昆合、/v 1. 37 (预热5mm 、JI j.依次加入底物(5.3) 4 rnL 4 mL(第二步),. /1合v v

10、 7. 37 C 7.37(1(解30min 飞J、Jv 一6依次加入终止液(5.7) 1 mL 4, mL(第1步,1 mL 一一一一一.一一一7混合v 、J、J总体积10 mL 10 mL 10 mL l一1 )标准空白加2mL乙酸缓冲液(5.1)。8.2.4 样品测定反应后的试样在室温下静置10min，如出现混浊需在离心机(5.7)上以4000 r/min离心10min. t清液以标准曲线的空白调零，在分光光度计(6.3)415nm波长处测定样品空白(A)和样品溶液(A)的吸光值.AA，为实调l吸光值。用直线回归方程计算植酸酶的活性。9 结果计算和表示9. 1 植酸酶活性U按式()和式(

11、2)计算9. 1. 1 绝对法) l ( 式中ztj试样中植酸酶的活性，U饵，C 根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性.U; F 试样溶液反应前的总稀释倍数;川试样质量，g;30一一反应时间.mlno9. 1. 2 相对法u=CXF ( 2 ) 式中:U试样中植酸酶的活性.U/g; C 根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性.U; F 试样溶液反应前的总稀释倍数;m 试样质量.g0 9. 2 结果表示两个平行样品的测定结果用算术平均值表示，保留整数。9. 3 重复性rJ-样品两个平行测定值的相对偏差，植酸酶产品不大于8%.添加植酸酶的各种饲料样品不大于10%。PO7 L GB/T 18634 - 2002 附录A(提示的附录)建议称祥最根据样品植酸酶活性的不同，建议称样量见表Al。表Al植酸酶活性!CU!g)5 000 2500 500 300 1 - O. 5 订称样量!gO. 1 1 O. 2 1 12 12 S 1 0