WS T 231-2002 用于纸片扩散法抗生素敏感试验的脱水Mueller-Hinton 琼脂的检验规程.pdf

1、c 50 共和WS/T 231 2002 于，、，几Protocols for the evaluation of dehydrated MuelIer-Hinton agar in tlie disk diffusion procedure for antimicrobial susceptibility testing 2002- 04-20发布2002- 07 -01实中华人民共和国卫生部发布飞L 一寸WS/T 231-2002 前坠t二，本标准是在卫生部颁发的全国临床检验操作规程)(第二版的基础上，参考NCCLS标准，结合中因国情及卫生系统的实际情况和要求而制定。本标准从2002年7月

2、1日本标准由卫生部医政司提出.本标准的附录A是标准的附录，附录B、附录C都是提示的附录.本标准由北京大学人民医院负责起草.本标准主要起草人z张正、杨娟、赵晓涛。本标准由卫生部委托卫生部临床检验中心负责解释。I -1 范围中华人民共利固卫生行业标准用于纸片扩散法抗生素敏感试验的脱水M uelIer-Hinton琼脂的检验规程Prolocols for Ihe evalualio叫ofdehydraled Mueller-Hinlon agar in Ihe disk diffusion procedure for anlimicrobial susceplibilily lesling WS/T

3、 231-2002 本规程规定了评价B!V产品批号的规则及评价新的参琼脂(M-H琼2日)产品批号的要求，包括制造商评价(M-H琼的规则1.本规程仅适用于评价纸片他试验中的质量，例如琼脂稀释2 材料2. 1 质控标准菌株生素敏感试验用M-H琼脂的检验.而不能保证M-H琼脂在其|索梯皮试验。用ATCC的冻干标准茵株制备质控菌株，根据ATCC的规定复苏菌种。所需的菌种有E金黄色葡萄球菌ATCC25 923，大肠埃希菌AT CC 25 922，铜绿假单胞菌ATCC27 853，粪肠球菌ATCC33 186 (或ATCC 29 212)，金黄色葡萄球商IATCC43 300和大肠埃希菌ATCC35 21

4、8. 2.2 菌株TSAtlf基培养将质控菌种的复苏液接种于两或三个含5%羊血的大豆-黯蛋白消化琼脂(TSA)平板上，置35C环境中孵育18h-24 h。2.3 肉汤增菌孵育结束后检查纯度并收获平板上的全部生长物。在含有15%甘泊的大豆-酌蛋白消化肉汤(TSB)中悬浮。(l5%TSB的制备:将脱水肉汤培养基30g溶于大约500mL去离子水中，并添加150 mL的甘泊，定容至1L.混匀.12C15min商压灭商。2.4 标准商株复苏接种平板的前一天.将所需的J!J(控菌种每种各融化一瓶，接种至含5%羊血的TSA平板上，在35C环境中孵育18h-24人孵育后，如果检查纯度满意，这些菌株就可以用于摆

5、种待测M-H培养基，按WS/T 125一1999纸片法抗菌药物敏感试验标准操作。2.5 质控菌种的更新定期用ATCC的新鲜冻干标准岗株更新贮在菌种。3 试验方法及流程3. 1 严格按照我国已有标准(WS/TI川中规定的步骤和时间进行纸片扩散法抗生素敏感试验。3. 2 按照下面的时间表进行试验。3.2. 1 第一天中华人民共和国卫生部2002- 04 - 20 2002- 07 -01实施1 L一WS/T 231- 2002 3.2.1.1 培养基制备2将38.0g的脱水Mueller-Hinton培养基加至1L去离子水或纯净水(中国药典标准)中.煮沸1min .121 C 15 min灭菌.冷

6、却至大约50C时倒板.3- 2.1.2 倒板，使培养基厚度为4mm-5 mm(通常150mm规格平皿需70mL)。对应于第2.1条中罗列的前三种质控菌，每种培养基(产品批和主要参考标准批准备三个平板。对应于剩余的三个质控菌，每种培养基准备一个平板。另外每种培养基准备一个平板测定pH值。3- 2.1.3 如WS/T125中所述，在25C测定pH值。pH值应为7.2-7.4。在制造商试验数据报告表(附录阶上记录检测批和参考批的pH值。3.2.1.4 如第2.4条所述，将冻存的质控菌株融解，用含5%羊血的TSAZF极做传代培养.3- 2. 2 第二天3.2.2.1 检查第一天制备的平板.如果平板表团

7、过于潮湿，应将其置于35C孵箱中或置于室温层流橱中，直至多余的水分蒸发掉。培养基表面应湿润，但不能有水漓。培养皿盖也不应有水滴.3.2.2.2 在质控茵培养平板上挑取儿个茵落，按WS/T125所述，将生长物在TSB中悬浮，并调整浊度为0.5麦氏标准(约(1-2)X 10cfu/mL).制备标化培养物。3.2.2. 3 接种下述每个质控菌的标化接种物，每种培养基接种三个平板z金黄色葡萄球菌ATCC 25 923.大肠埃希菌ATCC25922.铜绿假单胞菌ATCC27 853。下述质控菌每个接种一个平板z粪肠球菌ATCC33 186 (或ATCC29 212).金黄色葡萄球茵ATCC43 300.

8、大肠埃希菌ATCC 35 2180调整菌悬液浊度与接种所有平板间的时间间隔不要超过15min。每种质控茵株亦可不在同一天检测.3.2.2.4 如下所述在每个平板上贴上适量的含抗生素纸片(纸片含景与WS/T125中相同)。对于金黄色葡萄球菌ATCC25 923.使用下列含抗生素纸片z瓷氮节西林/克拉维酸、红霉素、氨节西林/舒巳坦、苯瞠西林、头抱喔吩、四环素、环丙沙星、万古霉素。对于大肠埃希菌ATCC25 922.使用下列含抗生素纸片g氨莘西林、氯霉素、头抱E草厉、庆大霉素、头泡西丁、磺胶二甲基异恶哇、头抱哩吩、四环素。对于铜绿假单胞菌ATCC27 853.使用下列含抗生素纸片2阿米卡星、庆大霉素

9、、头抱赈阁、亚胶培南、头抱E草肝、P拉西林、头抱他院、替卡西林、环丙沙星、妥布霉素.3.2.2.5 接种类肠球菌ATCC33 186(或ATCC29 212)的平板，贴两片磺胶增效剂/磺胶甲异恶瞠做胸背试验.接种金黄色葡萄球菌ATCC43 300的平板，贴两片苯瞠西林做MRSA试验.接种大肠埃希菌ATCC35 218的平板，贴两片阿莫西林.3. 2.2.6 将平板翻转琼脂朝上(盖朝下在35(:环境中孵育16h-18 h(金黄色葡萄球菌43300孵育24 h) 0 3.2.3 第三天3. 2. 3. 1 孵育结束后，在培养皿上方照明(反射光).在无反射黑色背景下，用两脚规(建议使用能直接读数的在

10、培养皿背面测量抑菌环直径，精确至0.1mmo亦可将平皿置于黑色无反射背景下，而使光线垂直及从操作者背后450角方向照射。由于此项规则需要测量两批培养基抑菌环直径均值的差异，故而所有测量应采用完全相同方式。对于金黄色葡萄球菌ATCC43 300.应用直射光仔细检查抑商环，以检出环内任何模糊生长及细小菌落。3. 2.3.2 按第4.1条和4.2条所述，将结果记录在数据纸上(附录盼。如果在个别试验中，由于纸片没有贴好，或者翻转平板时琼脂脱落等原因而没有得到三个重复结果，则试验必须重傲。4 结果解释4. 1 对于每种培养基(产品批和参考标准).接种金黄色葡萄球茵ATCC25 923、大肠埃希菌ATCC

11、 25 922和铜绿假单胞菌ATCC27853所做的抗生素敏感性试验，分别计算每种茵对同种抗生素纸片三个抑茵环直径的平均值。计算产品每批和参考培养基均值的差异，把结果记录在数据纸上附录白。2 主WS/T 231- 2002 4.2 对于粪肠球菌ATCC33 186(或ATCC29 212)、金黄色葡萄球菌ATCC43 300和大肠埃希菌ATCC 35 218.计算产品批抑菌环直径的平均值和参考标准批抑菌环直径的平均值之差.把结果记录在数据纸上(附录盼。4.3 对于可接受批，在抗生素敏感性试验中，由第4.1条确定的抑商环直径的差值应有90 %，;川mm.应全部川mmeEJ于贴磺胶增效剂/磺胶甲异

12、恶瞠纸片的类肠球菌ATCC33川(或ATCC29212).抑菌环直径应二三Omm.且清晰度比得上参考培养基.对于金黄色葡萄球茵ATCC43300.贴上苯哇西林纸片经h孵育后，应无抑茵环或抑菌环非常模糊，在苯略西林纸片周围都有细菌生长。对于大肠埃希茵ATC35 218.经氨韦西林/克拉维酸的抑菌环直径平均值应为17mm .21 mmo如果按种类肠球茵ATCq33 186(ATCC 29 212)、金黄色葡萄球菌ATCC43 300或大肠埃希菌ATCC35 218的参考培养基禾f寻到满意结果，则试验必须重做.4.4 对于可接受批.pH值应为7.2牛7.405 标签声明对于可接受批，可在产品标签上加

13、有下列声明z这批Mueller-Hinton琼脂已经根据我国当前出版的本标准进行检测，符合其要求。，对于每个创造商，当连续三批产品的数据经国家药品监督管理局有关机构检查通过后，才批准在标签上加此声明.在最初提交的检验产品时必须经此过程。3 WS/T 231- 2002 附录A(标准的附录)正确使用本标准的说明A1 在评价新参考培养基的规则中，一般过程与第3章所述相同，但所用的质控菌中粪肠球茵ATCC 33 186不能用ATCC29 212代替，且在记录时，除记录抑菌环直径外，还要记录其清晰度。其余质控菌相同.A2 在评价新参考培养基的规则中，对粪肠球菌ATCC33 186贴下列纸片z磺胶增效剂

14、/磺胶甲异恶瞠，磺胶增效剂，万古霉素。对金黄色葡萄球菌ATCC43300贴下列纸片2甲氧苯西林，苯瞠西林.对大肠埃希菌ATCC35 218贴下列纸片z阿莫西林/克拉维酸，氨苇西林/舒巴坦，替卡西林/克拉维酸.A3 在评价新参考培养基的规则中，金黄色葡萄球菌ATCC25923，大肠埃希茵ATCC25922，铜绿假单胞菌ATCC27 853，用候选批和主要参考批各需要进行30份重复试验。如果由于纸片没有贴好，或者翻转平皿时琼脂脱落等原因而没有得到30份重复的结果，使用至少28份重复试验的结果亦可。否则，该批号的所有30份重复试验必须重做。对于粪肠球菌ATCC33 186，金黄色葡萄球菌ATCC43

15、 300和大肠埃希菌ATCC35218，各仅需4份重复试验。A4 选择主要参考培养基的标准A4.1 金黄色葡萄球菌ATCC25 923，大肠埃希菌ATCC25 922，铜绿假单胞菌ATCC27 853的抑茵环直径的均值见WS/T125. A4.2 抑菌环直径的变异不应偏离平均值二个标准差。方差(5)应为0.5mmo A4.3 培养基的pH值应为7.27. 4. A4.4 当与主要参考培养基比较时，候选批抑茵环直径均值的90%必须在参考批均值的2.0mm以内，全部必须在3.0mm以内。A4.5 t值应在附录C计算确定的+2.663和一2.663之间。t的临界值都同样设为30个标本(参考批和检测批

16、)，且=0.01.A4.6 金黄色葡萄球商ATCC43300贴苯哑西林纸片，经24h孵育后，应无可分辨的抑菌环(平板上模糊生长或出现细小商落)。贴甲氧苯西林的平皿可能会观察到抑茵环。A4.7 由粪肠球菌ATCC33186贴磺胶增效JlIJ/磺胶甲异恶瞠的抑菌环结果显示，培养基应相对无胸昔，它应比得上主要参考培养基的清晰度，且直径至少20mm.由于粪肠球茵ATCC29 212在检测上不够敏感，因而不用于参考培养基的试验。A4.8 所有由大肠埃希菌ATCC35 218 得到的抑茵环直径的均值应在参考培养基均值的3.0mm 以内。A5辅助参考培养基的选择标准A5.1 辅助参考培养基批号仅次于符合第A

17、4条中标准的主要参考培养基，而且要满足以下条件sA5.2 pH值为7.27.4。A5.3 粪肠球菌ATCC33 186贴磺胶增效剂/磺胶甲异恶I些纸片的抑茵环直径结果满意。A5.4 与新的主要参考培养基相比，在30份重复试验中不应有超过三个的抑菌环直径均值相差3.0 mm 以上。A5.5 金黄色葡萄球菌ATCC43 300取得第A4.6条中叙述的同样结果。4 厂家名称zMueller-Hinton琼脂批号gpH , (规定7.2-7.4)国家标准sDiff值2试验zWS/T 231- 2002 附录B(提示的附录)制造商试验数据报告制造商试验数据报告日期2保质期s检测批.(1)粪肠球商胸背试验

18、(规定22兰20mm)(2)大肠埃希菌35218.贴阿莫西林/克拉维酸(规定17mm-21 mm) (3)金黄色葡萄球菌，贴苯略西林(MRSA试验)(规定为极其模糊的抑商环生长至无抑菌环)Diff值s代表检测批和标准琼脂抑菌环直径均值的差值，用毫米表示.差值大于2.0mm的应不超过10%(两种方法).不应有差值大于3.0mm者。试验结果z盯1自1标准琼脂检测批均值Diff值(1 ) (2) (3) 此方法基于以下假设2抑菌环验，通过=0.01(双侧)的双样本被检测出来.如果通过与参考批进行分割概率.附录C(提示的附录)择新参考培养基的统计学计算的段大方差(S)是0.5mm，对于每个纸片扩散法抗

19、生素敏感试，检测批和参考批抑菌环直径相差1mm及以上者有99%的概率，评价一个以上的候选批，则必须加以调整，根据检测批的数目C1 对于三种质控菌，在与其对应的抗生素所做的30份重复试验中，使用A4部分中的规贝叫定在参考培养基上和每种检测培养基上形成的30份重复的抑菌环直径。C2 对于每个纸片扩散法抗生素敏感试验取得的每组30份重复试验结果(n= 30.或者实际重复数目).计算均值(X)和方差(S)。C3 计算总体方差SOC4计算儿5 一寸NDDNF问NH民中华人民共和国卫生行业标准用于纸片扩散法抗生素敏感试验的脱水Mueller-Hin!on琼腊的检验规程WS/T 231-2002 * 中国标准出版社出版北京复兴门外三里洞北街16号邮政编码100045电话，68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经售68511548 晤印张3/4字数12千字2002年9月第一次印刷开本880X12301/16 2002年9月第一版印数1-6一一* 网址版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533WS/T