GB T 14933-1994 小麦中T-2毒素酶联免疫吸附测定方法(ELISA).pdf

1、GB/T 1493394 1 主题内容与适用范围 本标准规定了谷物中T-2毒素的酶联免疫吸附测定方法（ELISA）。 本标准适用于小麦及其制品中T-2毒素的测定。 本方法的最低检出量为1 g/kg。 第一篇 间 接 法 2 原理 将已知抗原吸附在固相载体表面，洗除未吸附抗原，加入一定量抗体与待测样品（含有抗原）提取液的混合液，竞争温育后，在固相载体表面形成抗原-抗体复合物。洗除多余抗体成分，然后加入酶标记的抗球蛋白的第二抗体结合物，与吸附在固体表面的抗原-抗体复合物相结合，再加入酶的底物。在酶的催化作用下， 底物发生降解反应，产生有色产物，通过酶标检测仪，测出酶底物的降解量，从而推知被测样品中

2、的抗原量。 3 试剂 本标准所用试剂，凡未指明规格者，均为分析纯，水为蒸馏水或用等纯度的水。 3.1 甲醇。 3.2 石油醚。 3.3 三氯甲烷。 3.4 无水乙醇。 3.5 乙酸乙酯。 3.6 二甲基甲酰胺。 3.7 四甲基联苯胺（TMB）。 3.8 吐温-20。 3.9 30过氧化氢（30H2O2）。3.10 抗体：杂交瘤细胞系1D7产生的抗T2毒素的特异性单克隆抗体。 3.11 抗原：T-2毒素与载体蛋白-牛血清白蛋白（BSA）的结合物。 3.12 兔抗鼠免疫球蛋白与辣根过氧化酶的结合物（酶标二抗）。 3.13 ELISA缓冲液系统 3.13.1 包被缓冲液为pH9.6的碳酸盐缓冲液，称

3、取1.59g碳酸钠（Na2CO3），2.93g碳酸氢钠页码，1/5GB/T 14933942006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbrR149330A.htm（NaHCO3），加水稀释至1000mL。 3.13.2 洗液为含0.05吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液（简称为PBS-T）配制方法为： 称取磷酸二氢钾（KH2PO4）0.2g，磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）2.9g氯化钠（NaCl）8.0g，氯化钾（KCl）0.2g，吐温-20 0.5mL，加水至1000mL。 3.13.3 底物缓冲液为pH5.0的磷酸柠檬酸缓冲液，配制方法为： 0.1mo

4、l/L柠檬酸（C6H8O7*H2O），即称取柠檬酸 19.2g，加水至1000mL，为甲液；0.2mol/L磷酸氢二钠（Na2HPO4），即称取磷酸氢二钠 71.7g，加水至 1000mL，为乙液； 取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加水至100mL，即可。 3.13.4 底物溶液：取50 LTMB（10mgTMB溶于1mL二甲基甲酰胺中）溶液+10mL底物缓冲液+10L30过氧化氢，混均。 3.14 T2毒素标准溶液 用甲醇配成1mg/mLT2毒素贮备液，20冰箱贮存。于检测当天，精密吸取贮备液，用20甲醇的PBS（配制方法同PBS-T，不加吐温-20即可）稀释成制备标准曲线的所需浓度。

5、4 仪器 所有玻璃器皿均用硫酸洗液浸泡，用自来水、蒸馏水冲洗。 4.1 酶标检测仪。 4.2 酶标板（40孔或96孔）。 4.3 电动振荡器。 4.4 电热恒温水浴锅。 4.5 具0.2mL尾管的10mL小浓缩瓶。 5 分析步骤 5.1 提取 称取20g粉碎并通过20目筛的样品，置200mL具塞锥形烧瓶中，加8mL水和100mL三氯甲烷无水乙醇（41），密塞，振荡1h，通过滤纸过滤，取25mL滤液于蒸发皿中，置90水浴上通风挥干。用50mL石油醚分次溶解蒸发皿中残渣，洗入250mL分液漏斗中，再用20mL甲醇-水（41）分次洗涤，转入同一分液漏斗中，振摇1.5min， 静置约15min，收下层

6、甲醇-水提取液过层析柱净化（层析柱的装备：在层析柱下端与小管相连结处塞约0.1g脱纸棉，尽量塞紧，先装入0.5g中性氧化铝，敲平表面，再加入0.4g活性碳，敲紧）。 将过柱后的洗脱液倒入蒸发皿中，并于水浴锅上浓缩至干，趁热加3mL乙酸乙酯，加热至沸，挥干，再重复一次，最后加3mL乙酸乙酯，冷至室温后转入 浓缩瓶中。用适量乙酸乙酯页码，2/5GB/T 14933942006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbrR149330A.htm洗涤蒸发皿，并入浓缩瓶中。将浓缩瓶置95水浴锅上，挥干冷却后，用含20甲醇的PBS定容，供ELISA检测之用。 5.2 ELISA检测

7、 5.2.1 用T-2-BSA（4 g/mL）包被酶标板，每孔100 L，4过夜； 5.2.2 酶标板用PBS-T洗3次，每次3min后，加入不同浓度的T-2标准溶液（制作标准曲线）或样品提取液 （检测样品中的毒素含量）与抗体溶液的混合液（11，每孔100 L，该混合液应于使用的前一天配好， 4过夜备用），置371h； 5.2.3 酶标板洗3次，每次3min后，加入酶标二抗，每孔100 L，371.5h； 5.2.4 同上述洗涤后，加入底物溶液，每孔100 L，3730min； 5.2.5 用1mol/L硫酸溶液终止反应，每孔50 L，于450nm处测定吸光度值。 6 计算 7 精密度 本法的

8、精密度为6.820.3，平行允许差为4.719.2。 第二篇 直 接 法 8 原理 将已知抗原吸附在固相载体表面，洗除未吸附的抗原，加入一定量的酶标记抗体与样品（含有抗原）提取液的混合液，竞争温育后，在固相载体表面形成抗原抗体酶复合物。洗除多余部分，加入酶的底物。在酶的催化作用下，底物发生降解反应，产生有色物质。通过酶标检测仪，测出酶底物的降解量，从而推知被测样品中的抗原量。 9 试剂 本标准所用试剂，凡未指明规格者，均为分析纯，水为蒸馏水或同等纯度的水。 9.1 甲醇。 9.2 石油醚。 9.3 三氯甲烷。 T2浓度（ng/g）= C V1/V2 D1/ M 式中： C酶标板上所测得的T-2

9、毒素的量（ng），根据标准曲线求得；V1样品提取液的体积mL；V2滴加样液的体积，mL；D样液的总稀释倍数；M样品质量，g。页码，3/5GB/T 14933942006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbrR149330A.htm9.4 无水乙醇。 9.5 乙酸乙酯。 9.6 二甲基甲酰胺。 9.7 四甲基联苯胺（TMB）。 9.8 吐温-20。 9.9 30过氧化氢（30H2O2）。9.10 抗T-2毒素单克隆抗体与辣根过氧化酶结合物。 9.11 抗原：T-2毒素与载体蛋白-牛血清白蛋白的结合物（T-2-BSA）。 9.12 ELISA缓冲液系统 9.12.1

10、包被缓冲液为pH9.6的碳酸盐缓冲液，称取1.59g碳酸钠（Na2CO3），2.93g碳酸氢钠（NaHCO3），加水稀释至1000mL。 9.12.2 洗液为含0.05吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液（简称为PBS-T） 配制方法为： 称取磷酸二氢钾（KH2PO4）0.2g，磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）2.9g，氯化钠（NaCl） 8.0g，氯化钾（KCl）0.2g，吐温-200.5mL，加水至1000mL。 9.12.3 底物缓冲液为pH5.0的磷酸柠檬酸缓冲液，配制方法为： 0.1mol/L柠檬酸（C6H8O7H2O）， 即称取柠檬酸 19.2g，加水至1000mL，为甲液；

11、0.2mol/L磷酸氢二钠（Na2HPO4），即称取磷酸氢二钠 71.7g，加水至 1000mL，为乙液； 取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加水至100mL，即可。 9.12.4 底物溶液：取50 L TMB（10mg TMB溶于1mL二甲基甲酰胺中）溶液+10mL底物缓冲液+10L30过氧化氢，混均。 9.13 T2 毒素标准溶液 用甲醇配成1mg/mLT-2毒素贮备液，20冰箱贮存。于检测当天，精密吸取贮备液，用20甲醇的PBS（配制方法同PBS-T，不加吐温-20即可） 稀释成制备标准曲线的所需浓度。 10 仪器 所有玻璃器皿均用硫酸洗液浸泡，用自来水、蒸馏水冲洗。 10.1 酶标

12、检测仪。 页码，4/5GB/T 14933942006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbrR149330A.htm10.2 酶标板（40孔或96孔）。 10.3 电动振荡器。 10.4 电热恒温水浴锅。 10.5 具0.2mL尾管的10mL小浓缩瓶。 11 分析步骤 11.1 提取 称取20g粉碎并通过20目筛的样品，置200mL具塞锥形烧瓶中，加8mL 水和100mL三氯甲烷无水乙醇（41），密塞，振荡1h，通过滤纸过滤，取25mL滤液于蒸发皿中，置90水浴上通风挥干。用50mL石油醚分次溶解蒸发皿中残渣，洗入250mL分液 漏斗中，再用20mL甲醇水（41）

13、分次洗涤，转入同一分液漏斗中，振摇1.5min， 静置约15min，收下层甲醇水提取液过层析柱净化（层析柱的装备：在层析柱下端与小管相连结处塞约0.1g脱纸棉，尽量塞紧，先装入0.5g中性氧化铝，敲平表面，再加入0.4g活性碳，敲紧）。 将过柱后的洗脱液倒入蒸发皿中，并于水浴锅上浓缩至干，趁热加3mL乙酸乙酯，加热至沸，挥干，再重复一次，最后加3mL乙酸乙酯，冷至室温后转入浓缩瓶中。用适量乙酸乙酯洗涤蒸发皿，并入浓缩瓶中。将浓缩瓶置95水浴锅上，挥干冷却后，用含20甲醇的PBS定容，供ELISA检测之用。 11.2 ELISA检测 11.2.1 用T-2-BSA（4 g/mL）包被酶标板，每孔

14、100 L，4过夜。 11.2.2 酶标板用PBS-T洗3次，每次3min后，加入不同浓度的T2标准溶液（制作标准曲线）或样品提取液（检测样品毒素含量）与抗体酶结合物溶液（1100）的混 合液（11，每孔100 L，该混合液应于使用的前一天配好，4过夜备用），置371.5h。 11.2.3 酶标板洗3次，每次3min后，加入底物溶液。每孔100 L，3730min。 11.2.4 用1mol/L硫酸溶液终止反应，每孔50 L，于450nm处测定吸光度值。 12 计算 13 精密度 本法的精密度为5.315.4，平行允许差为5.714.2。 T-2浓度（ng/g）C V1/V2 D1/ m 式中： C酶标板上所测得的T-2毒素的量（ng），根据标准曲线求得；V1样品提取液的体积，mL；V2滴加样液的体积，mL；D样液的总稀释倍数；m样品质量，g。页码，5/5GB/T 14933942006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbrR149330A.htm