GB T 18641-2002 伪狂犬病诊断技术.pdf

1、GB(T 18641 2002 前午一-H伪狂犬病(pseudorabies PR; Aujesz屿sdisease，AD)是危害猪、牛、羊、狗、猎、家兔等多种家畜和野生动物的种急性传染病。除猪以外的动物感染伪狂犬病病毒后，主要是以发热、奇痒和脑脊髓炎症状为特征.以死亡为结局，并呈散发形式。本病对养猪业危害最大，猪感染后可引起娃赈母猪流产、产死胎和木乃伊胎;仔猪大量死亡，15日龄内死亡率为100%，断奶仔猪死亡率10%ZO%，种猪不育，母猪返惰，空怀，公猪辜丸发炎肿胀、萎缩、失去种用能力;育肥猪增重缓慢、饲料报酬降低。本病皇世界性分布。本标准规定的病原学诊断方法主要用于死亡动物的病料检测和活体

2、动物的鼻拭子样品检测，其中聚合酶链反应具有快速、灵敏的特点，可用于大批样品的检测。血清学诊断主要用于非免疫功物的珍断、血清流行病学调查和免疫功物的抗体水平监测。中和试验特异性强，是国际通用的法定方法，可用于:1岸进出口检疫，胶乳凝集试验，简便快速、敏感性高、特异性强，适用于基层现场检测;酶联免疫吸附试验适用于实验室大批样品检查、产地检疫、流行病学调查和无本病健康猪群的建立。本标准的附录A、附录B、附录C、附录D都是标准的附录，附录E是提示的附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准由华中农业大学畜牧兽医学院负责起草，农业部动物检疫所参加起草。丰标准

3、主要起草人:陈焕春、何启盖、李晓成、吴斌、方六荣、金梅林、邱德新、吴美州。1:) .1 中华人民共和国国家标准GB/T 18641 -2002 伪狂犬病诊断技术Diagnostic techniques for Aujeszk 8 disease 1 范围本标准规定了伪狂犬病的诊断方法。本标准适用于猪、羊、犬、1苗等及其他易感动物伪狂犬病的诊断。其中病毒分离鉴定、聚合酶链式反町、家兔接种试验适用于伪狂犬病病毒的检测;中和试验、酶联免疫吸附试验适用于非免疫动物伪狂犬病抗体的检测以及免疫后抗体水平的监测;胶乳凝集试验适用于实验室和现场对伪狂犬病抗体的早期检拥L2 病毒分离鉴定2. 1 试验材料改良

4、最低要素营养液()MEM)培养基配方见附录A(标准的附录)，仓鼠肾细胞CBHK，)或猪肾细胞系(PK-15)细胞，新生辍牛血清，青霉素，链霉素，0.22m微孔滤膜，细胞培养瓶。2.2 操作步骤2.2.1 病料的采集z对死亡病畜或活体送检并处死的动物，以无菌手术采集大脑、三叉神经节、扁桃体、肺等组织，戒送实验室检测。2.2.2 样品处理:待检组织在灭菌乳钵内剪碎，如l人灭菌玻璃砂研磨，月1灭菌生理盐水或DMEM培养液(见附录A)制成1: 5乳剂，反复冻融二次，经3000 r/min离心30min后，取上清液经O.22尸m微孔滤膜过滤，加入青霉素溶液至最终浓度为300IU /mL、链霉素为100g

5、/mL.-70C保存作为接种材料。2. 2. 3 病料接种将病料滤液接种已长成单层的BHK细胞(或PK-15细胞)，接种量为培养液量的10% .:17l恒温箱中吸附1h，)JO入含10%新生楼牛血清(已经过56C 7j(浴灭活30min，过滤除菌，无支原体)的DMEM培养液，置37C温箱中培养。2.2.4 观察结果:接种后36h72h，细胞应出现典型的细胞病变效应(CP凹，表现为细胞变圆，拉网、脱落。如第一次接种不出现细胞病变，应将细胞培养物冻融后盲传三代，如仍无细胞病变，则判为伪狂犬如j病海检9!lj阴性。2. 2. 5 病毒的鉴定将出现细胞病变的细胞培养物，用聚合酶链反应或家兔接种试验，或

6、作进一步鉴志。3 聚合酶链反应3. 1 试验材料蛋白酶K，t一二烧基硫酸饷(SDS)，苯盼，三氯tjl烧，异戊醇(分析纯)，澳化乙键(EB)，TEN缓冲液见附法ll(标准的附录斤。11物扩J伪狂犬病毒基因中131651碱基对(bp)之间217bp基因片段，序列为，t游71物l1 , 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局2002-02-19批准2002 - 05 -01实施GB/T 18641-2002 5 -CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3，下游引物P2，5GTCCACGCCCCGCTTGAAGCT-3。3- 2 操作;骤3.2. 1 样品的采集对于病死或补杀动物，取大脑和一叉神

7、经节、扁桃体、肺等组织.X、f于待检活猪.m已灭菌的棉签，伸入猪鼻腔中，采取鼻粘液，即为鼻拭子，冷藏条件下送实验室检测。3- 2. 2 样品处理每份样品分别处理。采病料经组织研磨器充分研磨，按1, 5用TEN缓冲液(见附录B巾13)悬浮收集于离心管内，反复冻融3次，7000 r/min离心5min , ft日样品为鼻拭子，则加入2时.TEN缓冲液.充分挤压.取出棉拭子，7000r/min离心5min，取上清液472.5L，加人25/tl.()%l二皖基硫酸纳(见附录日中134)和2.5L的20mg/ml.蛋白酶K(见附录日中1.13)，50C水浴摇床土放置2h后加人等量的饱和酣溶液500L.涡

8、旋20s气离心取上清液，加等量的盼E二氯甲炕2异戍醇(25241)抽提一次，再用等量的三氯甲皖:异戍醇(241)拍摄次，最后用两倍的无水乙醇沉淀，真空抽干后加入20IL双蒸水溶解此即为模饭勺，-20(贮存备用。3- 2. 3 聚合酶链反庇(PCR)的操作程序先将制备的模板DNA置100C水浴0mln作变性处理，然后立即放于冰浴中。PCR反应体系(按摩尔浓度计算)为总体积25L，含有50mmol/L (氯化例)(KC) .10 mmol/L三疑甲基氨基甲炕盐酸(丁口s-HCD(pH9.，0. 1 %二三泾甲基氨基甲烧溶液(0.1 % Triton X-100) , 100尸mol/LdNTPs

9、, 0.35mol!L引物，2mol/L氯化续(MgCI2)，及0.5U台克CTaq)DNA聚会酶，2L模板DNAo最后加人矿物油约20L覆盖。扩增条件为，94C变性3min，进入循环，94(60 s , 65 C 60s , 72 C 60s. 40个循环后72C延伸5mino 3. 2. 4 PCR产物的检测:将样品分别加于1%琼脂凝胶板的各样品孔中，有一孔加标准阳性样品，每孔10L15LPCR扩增产物，进行电泳，澳化乙镀(见附录B中132)染色，在紫外光下观察结果。电泳区带迁移率与标准阳性样品区带迁移率相同的待检样品应判为阳性。为进步进行PCR扩增产物的特异性鉴定，可取PCR产物用Sal

10、I酶切，酶切产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，澳化乙链染色，在紫外光下观察并与标准分于量相对照，阳性样品可出现140岭和77bp两个片段。4 家兔接种试验4. 1 家兔的选择选拌健康成年家兔，用血清中如试验、胶军L凝集试验、琼脂扩散试验戎酶联免疫吸附试验检测，证实为伪狂犬病抗体阴性。4.2 病料的采集及处理尤菌采集疑为该病死亡或扑杀动物的脑组织、扁桃体、淋巴结，混合后剪碎，用组织匀浆器研磨，用火菌生理盐水配成1 5乳悬液，反复冻融23次后，以3000 r/min离心10min，取上清液加入青霉素和链霉素溶液，最终浓度分别为1001U/mL和100问ImL，置4C冰箱中作用12h，作为待检样品。4.

11、3 病料接种将待检样品经颈部皮下注射接种，每只家兔接种1mL2 mL。4.4 结果观察和判定4.4. 1 伪狂犬病毒感染阳性:被接种动物在接种后24h48 h注射部位出现奇痒，家兔啃咬注射局部，导致皮肤溃烂，家兔尖叫口吐白沫嘈最终死亡。4.4.2 伪归犬病毒感染阴性:接种家兔仍健活，判为阴性。5 血清中和试验5. 1 试验材料。.25%膜酶(膜蛋白酶250mg加入100mL汉克氏(Hanks)液中，充分溶解后，过滤除商，-20(保存)，PK-15细胞;伪狂犬病阳性血清、阴性血清、伪狂犬病标准弱毒株;96孔细胞培养板cGO/T 18641-2002 5. 2 操作步骤5. 2. 1 病毒半数组织

12、培养感染量(TCIO川的测定5.2.1.1 病毒培养和收获将伪狂犬病毒标准毒株饺种于长成单层的PK15细胞，接种量为培养液的十分之一.37C 培养，待出现病变后，冻融，收获病毒。5.2.1.2 病毒的滴定.用DMEM培养液将伪狂犬病病毒作连续10倍稀释，即10人IOLu-每个稀释度取1(I() IL hn人96孔细胞培养板中，随后加入经0.25%膜蛋白酶消化的PK-15细胞悬液100L(细胞含量以10个/mL左右为宜).每个稀释度作8个重复，并设lE常细胞培养对照。置37C5%二氧化碳烧养箱巾。5.2.1.3 TCII计算还日观察细胞病变和对照，共观察3d4 d天，并记录细胞病变孔数。按照Rc

13、ccJ-Muench法计算病毒的TCID川见附录E(提示的附录门。5. 2. 2 巾和l试验5.2.2.1 血清的处理将元菌采集的待检血清置56C水浴灭活30min 0 5. 2.2.2 血清的稀释.在细胞培养板各孔中加入50LDMEM捕养液，随后在第1孔中加入待检血清50L混合后.用微量移液器取出50L，加到第2孔中，混匀后取出50L再加入第3孔中，依此类推，自至第10孔(将混合液弃去50L)，血清稀释度即为1 2、14，1811024，每份待检血清稀释度作3个重复。5.2.2.3 加入病毒将501-含200个TC1)5O的病毒液加到不同稀释度的血清孔中，37C作用1h , 5.2.2.4

14、每血泊孔中加入100L经膜蛋白酶消化分散的PK-15细胞悬液(细胞含量以10个/rnL左右为宜h5.2.2.5 设心-对照组5.2.2.5.1 病毒回归试验每次试验每一块板上都设立病毒对照，先将200TClD,/50 mL病毒液作1、刊、10IJ、1IJOO倍稀释，每个稀释度作4孔，每孔加100L病毒液，然后每孔100LPK一15细胞悬液。5. 2.2. 5. 2 阳性1fTl清、阴性血清、待检血清和正常细胞对照。5.2.2.6 结果观察，L1观察，记录病变和非病变孔数.共观察7天。病毒回归试验中0.1TC1Doo应不引起细胞病变，而1OOTCID r.i引起细胞病变，阳性血清、阴性血清、待检

15、血清和正常细胞对照成立，测定结果方有效，否则该试验不能成立。5.2.3 计算抗体中和效价观察后确定能对细胞培养50%保护的血清最大稀释度，计算抗体中和效价。如抗体效价为1, 2及1 , 2以t.则判为伪狂犬病抗体阳性。6 酶联免瘦吸附试验6. 1 试验材料抗原、酶标抗体、阴性血清、阳性血清g底物邻苯二胶-过氧化氢(OPD-H202)潜液，抗原包被液、封闭液、冲洗液、终11_液配制方法见附录C(标准的附录)，酶标反应板。6. 2 操作步骤6. 2. 1 包被用包被液见附录C中C2)将抗原稀释到工作浓度加入酶标板孔内，每孔100L，37C作用1h后?i: 4(冰箱过夜。6.2.2 洗涤f!L于L内

16、液体，用冲洗液(见附录C巾C1)洗3次，每次3min，用吸水纸拍干。F23 封闭作孔力11入封闭液(见附录C中(100L:l7C 11用1h。按6.2. 2步骤洗涤。6.2.4 加入待检血洁和阴性、阳性血清对照1:)7 GBjT 18641-2002 待检血清经5日(30min灭活后，用冲洗液作1 40稀释，加入抗原孔中，每孔I00 fL;同时将阴性血清对照和l阳性血清对照各hu人三个抗原孔中，分别记为儿.A2.A:j和A4,A. A孔。37C作用1h，重复6.2. 2步骤。6.2.5 加入酶标抗体用冲洗液将酶标抗体按工作浓度稀释，每孔加入100L，37C作用1h，重复6.2. 2步骤。6.2

17、.6 加入底物邻苯二胶过氧化氢(PD-H，O，)(见附录C中C41每孔1001.，宰温避光显色25min 0 6.2.7 终止反应每孔加入50L终止液(见附录C中C5)终止反应。6.2.8 测定透光值()值在酶联免疫检测仪上于490nm波长处测定光吸收值。6.2.9 结果的判定6.2.9.1 阴性对照光吸收值()D)3孔(A，.A，、A，)的平均值(Nc.)按式(1li算A10D490十A20DHO十A30D490AML=l3 6.2.9.2 阳性对照01川孔(儿、Ac.A，)平均值(PC飞)按式(2)汁算:PC鬼A，OD，+ A,OD, + A6()刷一一二一一一一一3 6. 2. 9. 3

18、 血清枪测值与阳性对照血清检测值之比(SIP)值按式(3)计算:样品A490-J.Vc 51P PC -N(、如SIP注O.5 ，贝判为抗体阳性g如SIP0.5.则判为抗体阴性。7 胶事L凝集试验7.1 试验材料. ( 1 ) ,( 2 ) . ( 3 ) 伪狂犬病胶乳凝集抗原、伪狂犬病阳性血清、阴性血清，稀释液配制方法!;!，附录)(标准的附录)。7.2 操作步骤7. 2. 1 对照试验取等量的胶乳凝集试验抗原(约20L)分别与阴性血清、阳性血清在洁净的玻片仁说合，如分别出现直u下判定标准中的不凝集和等于或高于50%凝集，贝IJ对照组成立，可进行待检血清的检测。7.2.2 待检血清处理待检血

19、清不须热灭活或其他方式的灭活处理。待检血清的检测:将待检血清用稀释液(见附录0)作倍比稀释后，各取15L与等量胶乳凝集抗即;在洁净干燥的玻片t用竹签搅拌充分混合，在3min_ 5 min内观察结果。? 2. 3 判定标准可能出现以下几种凝集结果，即:100%凝集:混合液透亮，凝集颗粒聚集在液滴的边缘$75%凝集混合液几于透明，出现大的凝集颗粒，50%凝集凝集颗粒较细，液满略浑浊，25%凝集:有少量凝集颗粒，混合液浑浊$0凝集:无凝集颗粒出现，混合液呈乳白色均匀一致的浑浊。7.2.4 结果的判定以出现50%凝集程度的血清最高稀释倍数为该血清的抗体效价，其值二三1, 2步IJ为伪狂犬病抗体阳1 5

20、? GB/T 18641-2002 性，存则判为抗体阴性。如为阴性，叫用血清中和试验或酶联免疫吸附试验进步检测，可能出现以下三种结果.如为阴性，则判为伪狂犬病抗体阴性;如为可疑，建议在间隔2周后再检测，如这三种方法均为阴性或可疑，判为阴性，如这三种方法中任何种方法为阳性，则判为阳性;如中和试验和酶联免疫吸附试验均为阳性或某-种方法为阳性，均可判为伪狂犬病抗体阳性。159 GB/T 18641-2002 附录A(标准的附录)DMEM(商糖)培养糠的配制A1 量取去离子水950mL.置于d定的容器中。A2 将DMEM粉剂10g加于15C30C的去离子水中，边加边搅拌。A3 每1(1 00 mL培养

21、液加3.7日碳酸氢销(NaHCO，)。A4 加水至1000 mL.用1mol/L氢氧化纳)(NaOH)或盐酸HC)将培养液pH值调至低于pH6.9 7. 0，在过滤之前应盖紧容器瓶塞。A5 (f.即用孔径为0.22pm的微孔滤膜正压过滤除菌，4C冰箱保存备用。附录B(标准的附录)聚合酶链反应溶液的配制B1 TEN缓冲液氯化钙(CaCI，) 1), 00 mg (j mmol/Ll 王泾甲基氨基币烧盐酸(TrsHCI)(pH8. 0) 乙二胶四乙酸(EDTA) (pH8. 0) 1 210.00 mg(O mmol/Ll 372.00 mg( 1. 0 mmol/Ll 1 000 m/L 三蒸水

22、82 真化乙镀浓浓澳化乙键1. 0g 三蒸71:100 mL 磁力恍拌数小时以确保其熔解，然后用铝?自包裹容器或转移至棕色瓶中，保存于室温。注澳化乙键是强诱变剂，并有中度毒性，使用含有这种染料的溶液时务必戴上手套，称量染料时要戴国罩。83 蛋白酶K(20 mg/时.)(贮存液)f起甲基氨基甲烧(Tris)(pH7.8)乙二胶四乙酸(EDTA)(S)S) 气蒸水1. 2 mg(O. 01 mmol/Ll . 86 mg (0. 005 mmol/L) 5.0 g 1 000 mL 加入蛋白酶K.使成为20mg/mL.即为贮存液。使用浓度为50Ig/mLB4 10% t.一烧基硫酸纳(SDS)溶液

23、的配制在90时，水中溶解10g电泳级十二烧基硫酸铀，加热至68C助溶，加人浓盐酸调节溶液的pH值至7.2.加水定容至100mL.分装备用。附景C(标准的附录)酶联免自E吸附试验溶液的配制C1 冲洗液含0.05%吐温.20(Tween.20)pH7.4的磷酸盐缓冲液。将下列试剂按次序加入1000 rnL体积的容器中，充分溶解即成。1 !; IJ GB/T 18641-2002 氮化纳(NaCl)氟化梆(KCIJ磷酸氧二锅(Na，HPO， 12H,O) 磷酸二氢镑(KH，PO，) 吐温20(Tween-2)加蒸饱水.C2 抗原包被液。.025mol/L .pH9. 6碳酸盐缓冲液。碳重量锵CNaC

24、O，)碳酸氢锵(NaHCO，)j簇馈水c3封闭?在冲洗液牛血清白盖自(SA)C4 j良物溶液邻苯二艘过氧化氢(OPD-H20，) C4. 1 O. 1 mol/LpH5. 0磷酸盐拧橡酸就缓冲液8.0 g 0.2 g 0.2 g 2.告在0.5 mL 1000 mL 1. 59 g 2. 93日1 000 mL 100 mL 0.1 g 将下声lJ式剂按次!芋泌入100夺目L体积部容器中，充分溶解p成。磷酸氢二纳(Na，HPO， 12日20)拧镶酸蒸馆水C4.2 底物熔液O. 1 mol!L pH5. 0磷酸盐拧攘酸盐缓冲液邻苯二胶(OID);if1%过氧化氢(T-J20，) i这液对光敏感，

25、应避免强光交费苦。革E费2草草用。C5 终止液2 mol!L硫酸(H，SO，) 硫酸(H，SO，)蒸f辑水71. Ii g 19.2 g 1000 mL 100 mL 40 mg 0.15 mL 22.2 mL 177.8 mL F带策D(标准的附录)血清草草辈辈渡(0.1 mol/L pll7噜4磺酸越级;中液)将下功j试JiJ按次Ff加入1000 rnL体权的容器中z氯化纳(Na(、l)磷酸氢二锅(Na，HPO 12H,o) 磷般二氧铮(KH，PO，) 3在化仰(KCD8.02 g 3.87嚣。.163日0, 201日DII双蒸饿;j:手1 000时，?险生J后，充分济解，鼓后加入叠氮销(

26、NaN，)防腐，其终浓度为万分之。J fi 1 举例说明病毒稀释度10 -1 10 2 1 0 - 3 10 10- , 10 (1 10. I 10 10 GB/T 18641-2002 附录E(提示的附;jl:)病毒半数组织培养感染量TCID50的计算(按Reed-Muench法)表El细胞病变罩计孔数? 出现细胞不出现细胞出现不出现病变孔数病变孔数细胞病变细胞病变8 。51 。8 。43 。8 。35 。8 。27 。8 。19 。6 Z 11 2 4 4 口6 1 7 1 13 。8 。2 1 出现细胞病变细胞孔数百分比/%51 (51151)100 43 (43!43)00 35 (

27、35!35)100 27 (27!27)100 19 (9!19)IOO 一一-13 (11!13)84.6 1 1 (5!11 )45. 4 14 (1!14)7.1 21 。从表El可见该病毒的TCID，。在106(84.6%)和10(45.4%)之间，首先按式(El)计算距离比高于50%病变百分数50 距离比=. . . ( E 1 ) 高于50%病变百分数低于50%病变百分数I!(TCID, =高于50%稀释度对数+距离比稀释度对数84.6- 50 代人公式:距离比=一一一一一一=0.自884. 6 45.4 IgTCJD60= -6+0. 88X (-1)=一-6.88所以，TC)，=O/0.1 mL 由于病毒的稀释倍数是10-，倍，其稀释倍数的对数是(一) .因此可将t式获得的距离比(0.88)加引起细胞病变孔数高于细胞培养孔数50%的病毒稀释度的对数(6)上，因此该病毒的二rClD川应是10 制/O.lmLo162