GB T 22915-2008 口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测方法.pdf

1、ICS 11220B 41 固冒中华人民共和国国家标准GBT 229 1 52008口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测方法Protocol of universal fluorogenic RTPCR for foot and mouth disease virus2008-12-31发布 2009050 1实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局借寿中国国家标准化管理委员会厘111刖 罱GBT 229152008本标准参考了世界动物卫生组织(OIE)陆生动物诊断试验和疫苗手册(哺乳动物、禽鸟与蜜蜂)(第5版)。本标准的附录A、附录C为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部

2、提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国云南出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：花群义、杨云庆、秦智锋、周晓黎、卢体康、董俊、陶虹、阮周曦、叶弈优、林祥梅、吴绍强。1范围口蹄疫病毒荧光RTPCR检测方法本标准规定了口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测的操作方法。本标准适用于动物及其动物产品中口蹄疫病毒的检测。2缩略语下列缩略语适用于本标准。21荧光RT-PCR荧光反转录一聚合酶链反应。22 Cf值每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。23 RNA核糖核酸。24 DEPC焦碳酸磷酯。25

3、PBS磷酸盐缓冲盐水，配方见附录A。26 Taq酶TaqDNA聚合酶。27 FMDV口蹄疫病毒。3原理GBT 229152008根据E1蹄疫病毒各型共有的基因特定序列的保守片段，合成一对通用的特异性引物和一条通用的特异性探针。荧光探针的5 7端标记FAM荧光素，3 7端标记TAMRA荧光素，3端的淬灭基团在近距离内能吸收5 r端报告荧光基团发出的荧光信号。但在扩增时，由于Taq酶的513 7的外切活性，在延伸到荧光探针时，将其切断，两基团分离，淬灭作用消失，荧光信号产生。因此，可以通过检测荧光信号对核酸模板进行检测。4材料与试剂41仪器与器材411荧光RTPCR检测仪。412高速台式冷冻离心机

4、(离心速度12 000 rrain以上)。413台式离心机(离心速度3 000 rmin)。414混匀器。415冰箱(28和一20两种)。416微量可调移液器(5 pL，10 pL，100 pL，1 000 pL)及配套带滤芯吸头。417 Eppendorf管(15 mL)、透明薄壁PCR管(O2 mL)。GBT 22915200842试剂421 除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNA酶污染的容器(用DEPC水处理后高压灭菌)分装。422三氯甲烷。423异丙醇：一20预冷。424 PBS：配制见附录A。425 75乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，-20预冷。4

5、26 引物：上游引物5一TTAcAAACCTGTGATGGccTC_3，下游引物5-CGGAGATCAACTTCTCCTGTATG-3 7。427 荧光双标记探针(10 pmolL)：(FAM)51_ccTcTccTTTGcACGccGTGp3 7(TAMRA)。428口蹄疫病毒通用荧光RTPCR检测试剂盒：组成、功能及使用注意事项参见附录B。5抽样51采样工具511下列采样工具应经121土2，15 rain高压灭菌并烘干。512棉拭子。513剪刀、镊子。514注射器。515 15mLEppendorf管。516研钵。52样品采集521 采集的样品主要是口腔、蹄冠上的水泡上皮组织、水泡液、血液

6、、口腔分泌物和组织。采集后立即冷藏送检或置于含抗生素的PBS缓冲液中低温保藏。编号并作好记录。522水泡液及水泡皮：用75酒精轻轻消毒水泡表皮，去掉污物，用灭菌生理盐水擦去酒精，然后用无菌注射器穿刺水泡吸取水泡液，置于含抗生素的PBS缓冲液灭菌瓶中。水泡液采取后，将水泡皮以无菌术剪下，放人含抗生素的PBS缓冲液中。523 口腔分泌物和咽喉拭子：用拭子采取口腔分泌物或将拭子深人口腔内来回刮3次5次取分泌液，拭子一并放人盛有10mL含抗生素的PBS缓冲液的15mL Eppendorf管中。也可用食道探杯刮取咽喉液体，放人加有抗生素的PBS中。编号，冷藏送检或低温保藏。524血液：用真空采血管或无菌

7、注射器直接采取至无菌Eppendor管中，密封、编号后保存于4或送检。525肌肉或组织脏器：无菌采集待检样品，装人一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号，冷藏送检或低温保藏。53样品贮运样品采集后，放人密闭的塑料袋内(一个采样点的样品，放入一个塑料袋内)，于保温箱中加冰、密封，送实验室。54样品制备541水泡液、血液和口腔分泌物样品在混匀器上充分混合后，用经高压灭菌的镊子将拭子中的液体挤出，室温放置30 min，取上清液转入无菌的15 mL Eppendor管中，编号备用。542水泡皮、肌肉或组织脏器取待检样品20 g于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加10 mL PBS混匀，4下3 000 rm

8、in离心15 min，取上清液转入无菌的15 mL Eppendor管中，编号备用。2GBT 229 1 5200855样本存放制备的样本在28条件下保存应不超过24 h，若需长期保存应置70以下，但应避免反复冻融(冻融不超过三次)。6操作方法61 实验室标准化设置与管理要求口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测的实验室规范，见附录c。62样本的处理621在样本制备区进行。样品中总RNA提取的试剂盒，有商品化试剂盒出售，也可自行配制。622取n个灭菌的15 mL Eppendorf管，其中n为被检样品、阳性对照与阴性对照的数量之和，编号。623每管加入600 pL裂解液，分别加入被检样本、阴性对照、阳

9、性对照各200 pL，一份样本换用一个吸头，再加入200 pL三氯甲烷，混匀器上振荡混匀5 S。于4、以12 000 rrain离心15 min。624取与622相同数量灭菌的15 mL Eppendorf管，加入500“L异丙醇(一20预冷)，做标记。吸取623各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取500 pL，不能吸出中间层，颠倒混匀。625于4、以12 000 rrain离心15 rain(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)，小心倒去上清液，倒置于吸水纸上，沾干液体，不同样品应在吸水纸不同地方沾干；加入600xL75乙醇，颠倒洗涤。626于4、以12 000 r

10、rain离心10 min(EppendorI管开口保持朝离心机转轴方向放置)，小心倒去上清液，倒置于吸水纸上，沾于液体，不同样品应在吸水纸不同地方沾干。627以4 000 rmin离心10 S(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)，将管壁上的残余液体甩到管底部，小心倒去上清液，用微量加样器将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥3 min，不能过于干燥，以免RNA不溶。628各管加入11 pL DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，以2 000 rrain离心5 S，冰上保存备用。提取的RNA应在2 h内进行PCR扩增；若需长期保存应放置一70冰箱。6

11、3检测631扩增试剂准备在反应混合物配制区进行。从试剂盒中取出相应的荧光RTPCR反应液、Taq酶，在室温下融化后，以2 000 rrain离心5 S。设所需荧光RT-PCR检测总数为n(n-“+2+1)，其中“为被检样品数、2为阳性对照数、1为阴性对照数，按表1配制反应体系混合液。表1 配制反应体系混合液序号 组分 每管用量pL n管总用量pL1 荧光RT PCR反应液(2) 25 n252 raq酶 l n13 RT PCR反转录酶颗粒 12(颗) n12(颗)4 RNA酶抑制剂(RNasn) 1 15 ROX参考染料(ROX reference dye) 1 n16 DEPC水 12“L

12、 月12632反应体系混合液分装根据测试样品的数量(”)，向配制的反应体系混合液中加入n12颗RTPCR反转录酶颗粒，充3GBT 229 152008分混合均匀，按每个PCR管40 pL分装于02mL透明PCR管，将荧光PCR管放于96孔板上，一定要按顺序记录好被检样品管、阳性对照管、阴性对照管。转移至样本处理区。633加样在样本处理区进行。在各设定的PCR管中分别加入62，8中制备的RNA溶液10 vL，盖紧管盖，500 rrain离心30 s。转移至检测区。634荧光RT-PCR检测6341在检测区进行。将633中离心后的PCR管放人荧光RTPCR检测仪内，记录样本摆放顺序。在96孔板内(

13、表内)记录或填写被检样品(Unknown)、阳性对照(Pc)、阴性对照(NTC)。设置探针：5为FAM，3为TAMRA。634，2循环条件设置：第一阶段，反转录42，30 rain；第二阶段，预变性94，3 rain；第三阶段，9410 S，4530 s，721 rain，5个循环；第四阶段，94lo S，6030 S，40个循环，在第四阶段每个循环的退火延伸时收集荧光；试验检测结柬后，根据收集的荧光曲线和值判定结果。7结果判定71 结果分析条件设定直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。72质控标准721 阴性对照无Cf

14、值，并且无扩增曲线，一直为水平线。722阳性对照的c值应小于280，并出现典型的扩增曲线，2个阳性对照扩增曲线基本重合。否则，此次实验视为无效。73结果描述及判定731阴性无c值并且无扩增曲线，表示样品中无口蹄疫病毒。732阳性c值小于等于300，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在口蹄疫病毒。733有效原则Cf值在30O380的样品建议重做。重做结果无。值者为阴性，否则为阳性。附录A(规范性附录)试剂的配制GBT 229152008A1 A液02 molL磷酸二氢钠水溶液：磷酸二氢钠(NaH。PO。HzO)276 g，溶于蒸馏水中，最后稀释至1 000 mL。A2 B液02 molL磷酸氢二

15、钠水溶液：磷酸氢二钠(Na。HPO。7HzO)536 g(或NazHPOt12H20716 g，或Na：HPO；2H。0356 g)，加蒸馏水溶解，最后稀释至1 000 mL。A3 001 molL、pH72磷酸盐缓冲盐水(PBS)的配制取A液14 mL，B液36 mL，加氯化钠(NaCI)85 g，月蒸馏水稀释至1 000 mI，。经121215 rain高压灭菌，冷却后，无菌条件下按每毫升加入1 000 IU青霉素、l 000 ug链霉素。GBT 229 152008附录B(资料性附录)试剂盒的组成B1试剂盒组成每个试剂盒可做48个检测，包括以下成分：裂解液 30mL1盒DEPC水 2mL

16、1管RTPCR反应液(内含口蹄疫病毒的引物、探针) 750 pL1管RT-PCR酶 2颗粒12管Taq酶 12 pL1管阴性对照 1 mL1管阳性对照(非感染性体外转录RNA) 2 mL1管ROX参考染料(ROX reference dye)01 mL1管B2说明B21 裂解液的主要成分为异硫氰酸胍和酚，为RNA提取试剂，外观为红色液体，于4保存。B22 DEPC水，是用1DEPC处理后的去离子水，用于溶解RNA和稀释标准品。B23 RT-PCR反应液中含有特异性引物、探针及各种离子。B3功能试剂盒可用于动物组织样品(包括水泡皮、水泡液、组织、脏器、分泌物、血液、血清或血浆等)中口蹄疫病毒的检

17、测。B4使用时的注意事项B41在检测过程中，应严防不同样品间的交叉污染。B42反应液分装时应避免产生气泡，上机前检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。B43 RT-PCR酶颗粒极易吸潮失活，应在室温条件下置于干燥器内保存，使用时取出所需数量，剩余部分立即放回干燥器中。C1实验室设置要求附录C(规范性附录)口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测方法的实验室规范GBT 229152008c11实验室分为三个相对独立的工作区域：样本制备区、反应混合物配制区和检测区。c12工作区域应有明确标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用。C13每一区域应有专用的仪器设备。C14整个实验过程中均应使用无RNA

18、酶的一次性耗材，用到的玻璃器皿使用前应250干烤4 h以上，以彻底去除RNA酶。C15各区域的仪器设备应有明确标记，以避免设备物品从各自的区域内移出，造成不同的工作区域间设备物品发生混淆。C16进入各个工作区域严格遵循单一方向顺序，即只能从样本制备区、扩增反应混合物配制区至检测区。C 17在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服，以便于鉴别；离开工作区时，不得将各区特定的工作服带出。C18实验室清洁时应按样本制备区、扩增反应混合物配制区至检测区的顺序进行。C19不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染。C2工作区域仪器设备配置C21样本制备区(要求在负压实验室或具有三级生

19、物安全实验室内进行操作，BSL一3)样本制备区需配置以下仪器设备：28冰箱；一20冰箱；一高速台式冷冻离心机(4，12 000 rrain)；混匀器；一一常量加样器(O5肛L、2卜L、5 vL、10 pL、20 pL、50 pL、100 vL、300肛L、1 000 vL)可移动紫外灯(近工作台面)。c22反应混合物配制区反应混合物配制区需配置以下仪器设备：28冰箱；一20冰箱；手掌式离心机(3 000 rrain)；混匀器；微量加样器(o5 vL、2 pL、5 vL、10 vL、20 pL、50 pL、100 vL、300 pL、1 000 pL)可移动紫外灯(近工作台面)。C23检测区检测

20、区需配置以下仪器设备：荧光PCR仪(配计算机)；移动紫外灯；一一打印机。GBT 229 152008C3各工作区域功能及注意事项C31 样本制备区(要求在负压实验室或具有三级生物安全实验室内进行操作)样本制备区的功能及注意事项如下：标本的保存，核酸提取、贮存及其加人至扩增反应管，在样本制备区进行。避免在本区内不必要的走动。可在本区内设立正压条件以避免邻近区的气溶胶进入本区造成污染。为避免样本问的交叉污染，加人待测核酸后，应立即盖紧含反应混合液的反应管。用过的加样器吸头应放入专门的消毒(例如含次氯酸钠溶液)容器内。实验室桌椅表面每次工作后都要清洁，实验材料(原始样本、提取过程中样本与试剂的混合液

21、等)如出现外溅，应作清洁处理并作记录。对实验台适当的紫外照射(波长254 nm，与工作台面近距离)有助于灭活去污染。工作后通过移动紫外线灯管来确保对实验台面的充分照射。c32反应混合物配制区反应混合物配制区功能及注意事项如下：试剂的分装和反应混合液的制备在本区进行。一一用于标本制备的试剂应直接运送至反应混合物配制区，不能经过检测区，在打开含有反应混合液的离心管或试管前，应将其快速离心数秒。在整个本区的实验操作过程中，操作者应戴手套，并经常更换。工作结束后应立即对工作区进行清洁。本工作区的实验台表面应可耐受诸如次氯酸钠等化学物质的消毒清洁作用。“实验台表面用可移动紫外灯(波长254 nm)进行照射。C33检测区检测区功能及注意事项如下：基因片段(病毒RNA或cDNA)的扩增及扩增片段的分析在本区内进行。一本区注意避免通过本区的物品及工作服将扩增产物带出。为避免气溶胶所致的污染，应尽量减少在本区内的走动。一完成操作及每天工作后都应对实验室台面进行清洁和消毒，紫外照射方法与前面区域相同。如有溶液溅出，应处理并作记录。本区的清洁消毒和紫外照射方法同前面区域。C34使用时的注意事项在检测过程中，应严防不同样品问的交叉污染。反应液分装时应避免产生气泡，上机前检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。