GB T 23197-2008 鸡传染性支气管炎诊断技术.pdf

1、ICS 11220B 41 a雷,tl华人民共和国国家标准GBT 23 1 972008鸡传染性支气管炎诊断技术Diagnostic techniques for avian infectious bronchitis2008-12-31发布 200905-01实施丰瞀鹘紫瓣警糌赞星发布中国国家标准化管理委员会仅11刖 昌GBT 23 1 972008本标准对应于OIE陆生动物诊断试验和疫苗手册(2004)276鸡传染性支气管炎(avian infectious bronchitis)，其一致性程度为非等效。在此基础上，根据国内科研成果增加了反转录一聚合酶链反应和气管环组织培养血清中和试验，用

2、于病原的鉴定和抗体检测。本标准的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(sACTC 181)归口。本标准起草单位：中国动物卫生与流行病学中心、华南农业大学。本标准主要起草人：吴延功、廖明、王志亮、郭霄峰、刘佩兰、王永玲、孙承英。鸡传染性支气管炎诊断技术GBT 23 1 9720081范围本标准规定了鸡传染性支气管炎病毒分离、反转录一聚合酶链反应、微量血凝抑制试验以及气管环组织培养血清中和试验等四种诊断方法的技术要求。本标准适用于鸡传染性支气管炎的诊断和检疫。2 I临床诊断21鸡传染性支气管炎是鸡的一种急性、接触性传染病，临

3、床上有多种表现形式，根据病变类型，可将其分为：呼吸道型、肾型等，但以经典的呼吸道型发生的最为普遍。22呼吸道型表现为呼吸困难，有罗音或喘鸣音，雏鸡感染可引起死亡。23青年鸡和产蛋鸡感染后，可引起产蛋鸡停产或产蛋下降。表现为产蛋鸡产蛋下降，产软皮蛋、砂壳蛋或畸形蛋，蛋清稀薄如水。24肾型表现为病鸡排白色稀粪，脱水，死亡率高。25符合上述I|缶床症状之一者，可以怀疑鸡群感染鸡传染性支气管炎病毒，确诊需经实验室检验。3病原的分离31样品的采集311 对于急性呼吸道型的病鸡，应采取气管渗出物；对于刚扑杀的病鸡则采取支气管和肺组织。312对于肾型和产蛋下降型的病鸡，应采取发病鸡的肾脏或输卵管。也可从大肠

4、，尤其是盲肠扁桃体或粪便分离病毒，但从消化道分离到的病毒未必与现流行或发生的病毒有直接关系。32样品的处理321 将病料放在含有10 000 IUmL青霉素和10 mgmL链霉素的pH值为74的磷酸缓冲盐水(PBS)内，置冰盒内送往实验室。pH值为74的PBS的配方见附录A。322将病料磨碎，加含抗菌素的PBS制成体积分数为20的组织悬液，冻融3次，以3 000 g离心20 rain，取上清液，加入终浓度为1 000 IUmL的青霉素和终浓度为1 mgmL的链霉素，37下作用1 h后用于鸡胚接种。33分离培养331取病料上清液，接种于5枚9日龄11日龄的SPF鸡胚尿囊腔内，另5枚接种PBS，接

5、种量均为02 mL枚。37孵育。每天照蛋，24 h内死亡的鸡胚弃去。收集接种后3 d7 d的鸡胚尿囊液，将所有尿囊液混合，用含1 000 IUmL青霉素和1 mgmL链霉素的PBS稀释5倍10倍，继续在鸡胚内传代。典型的野毒株通常在鸡胚中传至第2代或第3代时，可见侏儒胚，传至第3代，某些鸡胚可出现死亡。含毒尿囊液置一60以下可长期保存，也可以冻干4保存。332将分离物经鸡胚传至3代或3代以上，收获接种后7 d仍存活的鸡胚，取胎儿，用剪刀剪除胎儿体外的附属物，并用吸水纸吸干胎儿表面的液体。如接种胎儿重量比对照胚最轻胎儿重量少2 g以上者，可初步判定为有病毒感染。333对病毒的进一步鉴定可通过反转

6、录一聚合酶链反应(RT-PCR)进行(见第4章)。4 反转录一聚合酶链反应(RT-PcR)4t核酸抽提411材料准备4111被检样品：所采集的病料(肺或肾等组织样品、棉拭子、尿囊液和细胞培养物)应新鲜，或者置1GBT 23 1 972008于一20或一70低温冰箱保存。41111组织样品的处理：往1 g3 g肺脏或肾脏等组织样品中加灭菌的085生理盐水研磨成5倍10倍悬浮液，反复冻融2次3次后，以4 0009离心10min，取上清液作核酸抽提用。411，12棉拭子的处理：将槔拭子充分捻动拧干后除去拭子，05 mL样品液经4 0009离心10 rain，取上清液作核酸抽提用。41113细胞培养物

7、：取1 mL细胞培养物反复冻融2次3次后，以4 0009离心10 rain后取上清液作核酸抽提用。41114阴性尿囊液：10日龄SPF鸡胚尿囊液。4，1115阳性病毒液：传染性支气管炎病毒M41株接种10日龄SPF鸡胚，孵育48 h后收获的尿囊液。4112异丙醇。41，13灭菌15mL离心管。4，114无RNA酶(RNase)水。41t5三氯甲烷(分析纯)。4116无RNase水配制的75乙醇溶液。4，12操作方法4，121 取100”L 411中的上清液或尿囊液置于一灭菌的15 mL离心管中，同时设立阴性尿囊液或阴性细胞培养液和传染性支气管炎病毒M41株阳性病毒液为对照，再分别加入900 p

8、L冰冷的裂解液，剧烈混合样品15 s，室温放置5 rain。41，22加入200 pL三氯甲烷，颠倒离心管混合2次，剧烈混合10 s4下以10 0009离心15 rain。4123吸取500 PL上层水相于新的15 mL灭菌离心管中，加入500 pL异丙醇，4放置10 min，4下以10 0009离心1 5 rain。41 24 小心弃去全部上清液，加入l mL无RNase水配制的75乙醇溶液，上下轻缓颠倒两次，4下以7 5009离心5 rain。4，125弃去全部上清，风干5 min10 min，即制得RNA。42反转录(RT)4，21材料准备4，211反转录酶(reverse transc

9、riptase)xL(AMv)，核糖核酸酶抑制剂(RNasin)和反转录引物。反转录引物为6个碱基长度的随机引物，序列为5 7 d(NNNNNN)3，其中N代表A或C或G或T四个碱基。4212 10 mmolL dNTPs。4213 05mL灭菌PCR管。422操作方法4221在一个洁净的05 mL灭菌PCR管中依次加入5AMV缓冲液2 pL，10 mmolL dNTPs0，5 pL，反转录引物20 pmol，核糖核酸酶抑制剂(RNasin)10 U，反转录酶AMV25 U，用无RNase水补足总体积25 pL，轻缓混匀。4222用4221中的反转录混合液重悬4125中制备的RNA，置于室温1

10、0min。4223放入42水浴1 h，取出冰浴2 rain，所得的反应液即为反转录产物cDNA。然后将cDNA置于一20保存或直接做PCR。4，3核酸扩增431材料准备4311 Taq酶，25 mmolL dNTPs，100 bp DNA分子质量标准。4。312 PCR混合引物4PS；包括两对引物(MsMx和3s3x)，分别针对传染性支气管炎病毒GBT 231972008(IBV)基因组的M基因及基因组3 7末端的非编码区，这两个基因区间保守性强。在该混合引物中，MxMs的引物浓度为4 pmolt-L，3 rs3 7x的引物浓度为5 pmolptL。引物序列如下：3s：5GGA AGA TAG

11、 GCA TGT AGC TT 3 7(20 nt)；3x：5 7CTA ACT CTA TAC TAG CCT AT 3 7(20 nt)；Ms：5CCT AAG AAC GGT TGG AAT 3 7(18 nt)；Mx：51TAC TCT CTA CAC ACA CAC 3 7(18 nt)。4313 05 mL灭菌离心管。4314 20琼脂糖凝胶(含05 tlgmL溴化乙锭)，其配制方法见附录A。432操作方法4321在一个洁净的05 mL灭菌PCR管中依次加入无RNase水185 pL，10PCR缓冲液25 pL，25 mmolL dNTPs 2 tlL，4PS PCR混合引物15

12、pL，25 U Taq酶05 pL，轻缓混匀。4322加入2 pL 4223中制备中的cDNA，轻缓混匀。4323置于PCR仪中运行，943 min，9440 s，5330 s，7230 S，30个循环；72，7 rain。同时，设立以传染性支气管炎病毒M41株的cDNA为模板的阳性IBV病毒对照和阴性尿囊液或阴性细胞培养物的cDNA为模板的阴性对照。4324 PCR产物的检测：待PCR反应结束后，每个PCR样品取5 pL于含05 flgmL EB的20琼脂糖凝胶孔中电泳，同时加入5 pL标准100 bp DNA分子量标准物作为参照。在75 V恒压电泳30 rain，取凝胶置于紫外灯下观察或成

13、像。44检测与判定441 阳性对照在约740 bp和290 bp处分别有一条特异的DNA条带，阴性对照则无相应的特异条带出现，则实验成立。442待检样品在相应位置如出现特异性条带，或者仅在约740 bp出现条带或者仅在约290 bp处出现特异条带，则均可判为阳性。443如果需要进一步验证的话，可将获得的大小约为740 bp或290 bp的PCR产物回收纯化后测序，将测序结果提交美国国家生物技术信息中心(NCBI)进行BLAST分析。如果BLAST结果显示：大小约为740 bp的测定序列与基因数据库(GenBank)中注册的IBV膜蛋白序列同源性最高，或者大小约为290 bp的测定序列与GenB

14、ank中注册的IBV基因组3末端序列同源性最高，则进一步确证检测结果阳性。5微量血凝抑制试验51准备511器材5111微量反应板：96孔，v形底，同一次试验使用的反应板孔底角度应相同。5112塑料采血管：内径2mm，长10 cm。512试剂5121稀释液：pH74磷酸缓冲盐水(PBS)。5122浓缩抗原：由指定单位提供，按说明书使用，置4保存。5123标准阳性血清：由指定单位提供，按说明书使用。5124阿氏液(Alsever)，配制方法见附录A。5125 1鸡红细胞悬液：采不少于3只健康成年鸡血液，以1：2的比例与阿氏液混匀，用20倍量PBS洗涤3次4次，每次以1 5009离心5 rain，最

15、后一次10 rain，用PBS配成体积分数为1的悬液。513被检血清刺破鸡羽下静脉，用毛细塑胶管引进血流6 cm8 cm长，烧融一端，镊夹封lZl。血液凝固析出血清3GBT 231972008后1 5009离心5 rain，剪取血清端，封口备用。注：普查或疾病流行时，每群采血鸡不少于30只。52操作521微量血凝试验5211 于V形血凝板的每孔中滴加PBS 25吐，共滴四排。5212吸取抗原滴加于第一列孔，每孔25 pL，然后按由左到右顺序倍比稀释至第11列孔，再从第11列孔各吸25 pL弃之。最后一列不加抗原作对照。各孔补加PBS 25 pL。5213于每孔中加入1红细胞悬液25 pL，置微

16、量混合器上振荡1 min。5214放室温下(22-25)40 rain后根据血凝图像判定结果。5215凝集程度的判定a)完全凝集(+)：V形孔的尖部无红细胞沉淀块；b)不完全凝集(+)：V形孔的尖部有较明显的红细胞沉淀块，但整个孔底散布较多的凝集红细胞；c)不完全沉淀(土)：V形孔的尖部有较多的沉淀红细胞，孔底其他部分有少量凝集红细胞散布；d)完全沉淀(一)：红细胞都沉积于v形孔的尖部，孔底其他部分无可见的红细胞。5216以出现完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝滴度。每次做四排，以几何均值表示结果。5217计算出含4个血凝单位的抗原浓度，将血凝滴度除以4即为4个血凝单位的抗原应稀释的倍数。

17、522微量血凝抑制试验5221取25 pL PBS分别加入V形96孔微量血凝板的各孔内。5222吸取被检血清25 pL于第1孔中，混匀后吸z5 pL于第2孔，依次倍比稀释至第11孔，最后弃去25 pL。5223除第1列孔不加抗原外，吸取4个血凝单位的抗原25 pL加入第2列第12列各孔。5224置室温下感作30 min。5225加25 pL 1红细胞悬液于各孔中，振荡混匀后，室温下静置40 rain，判读结果。5226第1列孔为血清对照孔，第12列孔为抗原对照孔，每次测定还应设已知滴度的标准阳性血清作对照。5227判定a)红细胞凝集程度的判定：同5215的规定；b)血凝抑制试验结果的判定：在抗

18、原对照出现完全凝集，血清对照出现完全沉淀的情况下，以完全抑制红细胞凝集的最大稀释倍数为该血清的血凝抑制滴度。若鸡群没有接种过鸡传染性支气管炎疫苗，且有的鸡血清滴度达到41092以上，说明鸡群已受传染性支气管炎的感染。6气管环组织培养血清中和试验61材料准备611器材眼科剪、眼科镊子、平皿、吸管、薄青霉素瓶(5 mL、10 mL)、注射器、离心管、超净工作台、37培养箱、倒置显微镜、冰箱。612试剂HankS液、04酚红溶液、7碳酸氢钠(NaHc0。)溶液、MEM综合培养液、犊牛血清(使用前经56灭能30 min)、抗菌素溶液，配方见附录A。613 SPF鸡胚于37温箱孵育至18日龄20日龄。4

19、GBIT 231972008614抗原按说明书使用，置一70冰箱冻结保存。615血清6，151标准阳性血清：按说明书使用，用前经56灭能30 rain。6152标准阴性血清：按说明书使用，用前经56灭能30 min。6153被检血清：每群鸡随机采取10份20份血样，分离血清。6154采血法：用灭菌注射器经心脏无菌采血2 mL3 mL，迅速移人灭菌离。tL,管内，待凝固析出血清后，以1 5009离心5 min，将血清移入青霉素瓶内。试验前将血清经56灭能30 min后备用。62操作方法62，1气管环组织培养(TOC)取18日龄20 B龄的鸡胚，用碘酊消毒气室部位，于超净工作台内打开蛋壳，用无菌眼

20、科镊子拨开蛋壳膜和绒毛尿囊膜，小心取出鸡胚，置于灭菌的平皿内。用眼科剪剪开鸡胚颈部皮肤，找出气管，仔细地去除气管周围的结缔组织和脂肪，取出气管于含100 UmL青霉素和100 vgmL链霉素的HankS液中轻轻洗两次，然后用眼科剪将气管剪成1 mm厚的气管环组织。将一个气管环组织置于一个青霉素瓶内，加入含2犊牛血清的MEM培养液(pH值7274)1mL，置37培养箱内培养24 h后，取出置倒置显微镜下观察。观察前，适度摇荡，使培养物分泌的黏液溶于液体中。见气管环组织培养物上皮完整、纤毛运动活泼，即可供作传染性支气管炎病毒的滴定。622传染性支气管炎病毒对气管环组织培养半数感染量(TOC-ID，

21、。)的滴定随机从一70冰箱中取出一支抗原，用不含犊牛血清的MEM培养液(pH值7274)按10。至10_9稀释，每个稀释度的培养液接种5个气管环组织培养物，取15个不接种病毒的气管环组织培养物，每个加入稀释液1 mL作为空白对照。置37温箱内培养6 d后判定结果。62。3 TOC-ID50结果判定6231气管环组织培养出现病变的判定a) +：气管环组织培养物周边无一个纤毛运动，上皮细胞脱落；b) +：气管环组织培养物周边有95以上纤毛停止运动，上皮细胞不完全脱落；c) 士：气管环组织培养物周边有5095纤毛停止运动。上皮细胞不脱落；d)一：气管环组织培养物周边纤毛运动正常，上皮细胞不脱落。62

22、32取培养6 d的气管环组织培养物，振荡以除去黏附在培养物黏膜表层的黏性分泌物，置倒置显微镜下观察，并记录结果。判定结果时，以气管环组织培养物表现“+”或“+”的计为感染，以表现“土”或“一”的计为不感染。62，3，3按ReedMiiench法计算TOC-IDs。，参见附录B。6234将气管环组织培养(TOC)试验重复再做三次。计算出四次测定结果的几何平均值。该平均值即为该批抗原滴度，置-70可使用一年，但抗原严禁反复冻融。624气管环组织培养血清中和试验采用恒量病毒、变量血清的中和试验方法。将待检血清用不含犊牛血清的MEM培养液先作1：10稀释后，再作倍比稀释，如1：2，1：4，1：256等

23、。取每个稀释度的血清25 mL，加入25 mL 200个TOC-ID。病毒，充分混匀后置37温箱内感作1 h，每个滴度的混合液分别接种于5个气管环组织培养物，使每个气管环组织培养物浸于1 mL混合液中。置37培养箱内培养6 d后判定结果。625对照在进行中和试验的同时，设以下对照：a)病毒对照：将抗原用Hanks液稀释成每个接种剂量含10-2个102个TOC-IDso，每个滴度接种于5个气管环组织培养物，接种量为1 mL；b) 血清毒性对照：将低倍稀释的待检血清加入5个气管环组织培养物，每个加1 mL；5GBT 23 1972008c) 气管环组织培养物空白对照：取5个气管环组织培养物，各加入

24、1 mL培养液；d) 阳性血清和阴性血清对照：与待检血清进行平行试验，操作步骤同624。63结果判定631气管环组织培养出现病变的结果判定方法参见6231。632对照试验应出现下列结果：a)气管环组织培养物空白对照，应表现为“士”或“一”；b)病毒对照，10_1个、101个TOC-ID；。组应出现“土”或“一”，而102个TOC-ID。组必需出现“+”；c) 血清毒性对照，气管环组织培养物应出现“一”；d) 阳性对照血清应呈现预期的中和效价，阴性血清无中和效价。633在对照结果正常的情况下，记录气管环组织培养物纤毛运动和上皮细胞脱落的情况，以在病毒血清混合作用后能使气管环组织培养物出现“+”的

25、血清的最高稀释倍数为该血清的终点滴度。按ReedMiiench法计算血清的中和效价。7综合判定71 IBV的诊断方法有多种。依据I临床症状和病理变化只可作出初步诊断，确诊应依靠实验室检查。病毒的分离与鉴定多用于急性病例的确诊和新疫区的确定，RT-PCR适用于该病病原的快速诊断。血清学方法可用于IBV抗体的检测和血清型的鉴定。微量血凝抑制试验群体水平上进行血清学诊断较易操作、特异性强、敏感性高。气管环组织培养血清中和试验操作复杂，仅适于IBV鉴定。72当在临床上怀疑有IBV感染时，可根据实际情况，由上述几种方法中选用一种或两种方法进行确诊，对于未接种过IBV疫苗，经任何一种方法检测呈阳性结果时，

26、都可最终判定为IBV感染鸡群。对接种过IBV疫苗并在疫苗免疫期内的鸡或已超过疫苗免疫期的鸡，当病毒分离鉴定试验为阳性结果时，可终判为IBV感染鸡；当仅血清学试验呈阳性结果时，应结合病史和疫苗接种史进行综合判定，不可一律视为IBV感染鸡群。附录A(规范性附录)试剂配制GBT 231972008A1 pH74磷酸缓冲盐水(PBS)的配制磷酸氢二钠(Na。HPO。12H。0) 2902 g磷酸二氢钠(NaH2PO。2H20) 296 g氯化钠(Nacl) 85 g取上述试剂溶于1 000 mL蒸馏水中，6894 kPa灭菌15 min，4保存。A2 20琼脂糖凝胶(含05 ILgmL溴化乙锭)在10

27、0 mL TAE缓冲液(004 molL Tris一乙酸，0001 molL EDTA)中加入2o g琼脂糖，熔化后加入溴化乙锭(EB)至终浓度05 pgmL后即可灌制凝胶。A3阿氏液的配制葡萄糖(C。H，。0。H。O) 225 g柠檬酸三钠(Na。C。H，O，2H。O) O91 g柠檬酸(C。H。O，H：0)006 g氯化钠(NaCl)042 g加蒸馏水至100 mL，溶解，分装，70 kPa灭菌20 min，4保存备用。A4 Hanks液的配制A41成分A411母液AA4111溶液1氯化钠(NaCI) 160 g氯化钾(KCl)8 g硫酸镁(MgSOt7Hzo) 2 g氯化镁(MgCl：6

28、H。O) 2 g将上述各成分溶于800 mL无离子水中。A4112溶液2取氯化钙(CaCl：)28 g，溶于100 mL无离子水中。A4113配制将A4111和A4112两种溶液混合后，加无离子水至1 000 mL，并加2 mL三氯甲烷作为防腐剂，保存于04冰箱内。A412母液B磷酸二氢钾(KH：PO。) 12 g磷酸氢二钠(Na2 HP0412H20) 304 g葡萄糖(CsH z zosHzo)85 g将上述三种成分溶于800 mL无离子水中，最后加入100 mL 04酚红溶液。加无离子水至1 000 mL，加入2 mL三氯甲烷防腐，04保存。7GBT 231972008A42应用液取母液

29、A、B各1份，无离子水18份，混匀后6694 kPa灭菌15min，置04冰箱内备用。使用时于100 mL Hanks液中加7碳酸氢钠调pH值至7276。A。5 04酚红液的配制称取酚红置研钵中，逐渐滴人01 molL氢氧化钠(NaOH)，不断研磨至颗粒完全溶解，再加入适量去离子水，使酚红最终浓度为04。A6 7NaC(h的配制称取7 g碳酸氢钠溶于100 mL去离子水中，6894 kPa灭菌15 rain，置04备用。A7抗菌素溶液的配制取青霉素1 000 000 IU、链霉素1 000 000zg，用灭菌去离子水配成100 mL的上述两种抗菌素的混合液。分装小瓶，于一20冻结保存。使用时于

30、100 mL HankS液或培养液中加入此种抗菌素溶液1 mL。附录B(资料性附录)TOC-ID5a和血清中和效价滴定的Reed-Mefmch法GBT 231972008B1 TOc-ID50的测定将病毒液在灭菌的10mL青霉素瓶内作连续的10倍稀释，即用5mL吸管吸取1 mL病毒液，加入已装有9mL的无血清MEM培养液的第1个小青霉素瓶内，将混合液充分振荡，并另换一支新的5mL吸管，吹打混合后，吸取1 mL移于第2瓶9mL的199培养液中，更换吸管，如上充分振荡和吹打混匀后，再吸取l mL加入第3瓶，连续如此操作，即可做成连续的一系列10稀释液。吸取每一稀释度的病毒液1 mL，加入含纤毛上皮

31、运动良好的气管环组织培养物的青霉素瓶内，每个稀释度的病毒液接种5瓶。于37静止培养，逐日观察，共观察5 d。按表B1所举例子计算TOCID表B1 TOC-ID50的测定和计算(ReedMefineh法)观察结果 累 计 出现病变的瓶数病毒液稀释度 TOC总数病变TOC数 正常TOC数 病变TOC数 正常TOC数 所占百分率101 十5 0 28 O 28 100(Z828)102 5 0 23 0 23 loO(2323)10 3 十5 +0 18 O 18 100(1818)10 o f 5 0 13 O 13 loo(1313)103 4 I 8 1 9 889(89)10一6 十3 2

32、4 3 7 571(47)Io 7 十1 0 4 1 7 8 1Z5(18)10一8 o 5 0 12 12 o(o12)10 9 十o +5 0 17 17 o(oll7)出现病变的TOC数和正常TOC数分别列于表B1的第2列和第3列，它们的累计数分别列于第4和第5列(根据箭头所示方向)，第6列为TOC总数，第7列为出现病变的TOC数占TOC总数的百分率。可见该病毒株的TO&ID；。在106(571)和lO。(125)之间，其确切稀释倍数可按下列公式计算： 丽丽乎糍键鹬磐餐臻群巍丽姐16571 12 5(高于50的百分数)一(低于50的百分数) 因此该病毒的TOC-IDs。应是10“mL。查

33、反对数，得1 445 000，即该病毒1 445 000稀释可保护50的气管环组织培养物免于出现病变。B2滴定血清中和效价的Reed-Mefineh法取200个TOC ID。的病毒液，加入等量不同稀释度的待检血清，充分混合并感作后，接种TOC，按表B2示例计算血清中和效价。GBT 231972008表B2 固定病毒稀释血清法示例累计和血清稀释度感染TOC数 正常TOC数(病毒量固定)感染 正常 感染比例 保护率1；4(10-0 6) 0 5十 0 11 011 1001：16(10_1 2) I 4十 1 6 17 85 71：64(10_1 8) 3 2十 4 2 46 3331：256(10-2 4) 5 0十 5 O s5 01：l 024(10“o) 5 0十 14 O 55 OlO按Reed-Meiinch法计算，血清稀释度介于101。和10一1 8之问时能保护50TOC免受感染。距离比例一(857-50)(857333)一3571SZ4=O68高于50保护率血清稀释度的对数+距离比例稀释系数的对数一一124-068(一06)一一12041一一161161的反对数一140，即1：40稀释的待检血清可保护50的TOC免受感染。