SN T 1869-2007 食品中多种致病菌快速检测方法 PCR法.pdf

1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/ T 1869-2007 食品中多种致病菌快速检测方法PCR法Rapid detection methods for pathogens in foods-PCR method 2007-04-06发布2007-10-16实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检亵总局目IJ=S 本标准的附录A是规范性附录，附录B、附录C和附录D是资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/ T 1869-2007 本标准起草单位:中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国汕头出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和

2、国黑龙江出入境检验检疫局、中国合格评定国家认可委员会、大连产品质量检验所、中华人民共和国青岛出入境检验检疫局、中华人民共和国内蒙古出入境检验检疫局、中华人民共和国浙江出入境检验检疫局、深圳太太基因工程有限公司。本标准起草人:卢行安、许业莉、曹际娟、李苏龙、谢昭聪、朱海、李宏、郑卫平、秦成、王刚、刘艳凯、雷质文、刘中学、施伟良、孙杰、刘冉、郑秋月、段莹、张经纬、肖性龙。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。I 1 范围食品中多种致病菌快速检测方法PCR法SN/ T 1869-2007 本标准规定了用普通PCR技术快速检测食品中沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李

3、斯特氏菌、空肠弯曲菌、肠出血性大肠埃希氏菌0157: H7、副溶血性弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌的方法;用BAXG全自动致病菌PCR检测系统1)检测食品中沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、空肠弯曲菌、肠出血性大肠埃希氏菌0157: H7和阪崎肠杆菌的方法。本标准适用于食品中沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、空肠弯曲菌、肠出血性大肠埃希氏菌0157: H7、副溶血性弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌的检验.2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条敏.凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容或修订版均不适用于本标准，然而

4、，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/ T 4789. 4食品微生物学检验沙门氏菌检验GB/ T 4789. 5 食品微生物学检验志贺氏菌检验CBj T 4789. 6食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验GBj T 4789.7食品微生物学检验副溶血性弧菌检验GB/ T 4789. 8 食品微生物学检验小肠结肠炎耶尔森氏菌检验GBj T 4789. 9 食品微生物学检验空肠弯曲菌检验GBj T 4789. 10食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验GBj T 4789. 30 食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验

5、GBj T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB 19489实验室生物安全通用要求SN 0170 出口食品中沙门氏菌检验方法SN 0172 出口食品中金黄色葡萄球菌检验方法SN 0173 出口食品副榕血性弧菌检验方法SN 0174 出口食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌检验方法SN 0175 出口食品中空肠弯曲菌检验方法SN 0184 出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验方法SNj T 0973 进出口肉及肉制品中肠出血性大肠杆菌0157: H7检验方法SNj T 1022 出口食品中霍乱弧菌检验方法WSj T 230 临床珍断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用ISO 6579 微生物学一一沙门

6、氏菌检验方法指南ISO 11290-1 食品和动物饲料微生物学一一单核细胞熠生李斯特氏菌定性和定量检测方法第1部分:定性检测方法1)为樊国杜邦公司(DuPonlQualicon)的产品.SN/ T 1869-2007 IS0 16654 食品和动物饲料微生物学一大肠杆菌0157检测方法NMKL No.156 北欧食品协会食品中致病性弧菌定性和定量检测方法FDA/ BAM Chapter 5 美国食品药品管理局微生物学分析手册第2章沙门氏菌FDA/ BAM Chapter 9美国食品药品管理局微生物学分析手册第9章弧菌FDA/ BAM Chapter 10 美国食品药品管理局微生物学分析手册食品

7、中单核细胞增生李斯特氏菌定性和定盘检测方法USDA/ FSIS MLG4C. 01 美国农业部食品安全检验局生肉、畜嗣体擦拭样品、整鸡淋洗液、即食食品、禽肉制品和巴氏蛋制品中沙门氏菌BAX-PCR筛选方法USDA/ PSIS MLG 8人01 美国农业部食品安全检验局单核细胞增生李斯特氏菌BAX筛选方法3 缩略语3. 1 3. 2 3.3 3.4 3.5 3.6 3. 7 3.8 3.9 下列缩略语适合于本标准.聚合酶链反应，简称PCRodNTP deoxyri 脱氧核营三磷酸.dATP dxyadenosine 脱氧腺昔三磷酸。dGTP dxyguanosine 脱氧鸟昔二磷酸.dCTP d

8、eoxycytidine tri 脱氧胞背三磷酸。dTTP deoxythymidine tri 脱氧胸昔三磷酸。dUTP deoxyuridine triphosphate 脱氧尿昔二磷酸。SDS sodium dodecyl sulfate 十二烧基硫酸铺oTris tris(hydroxymethyl) aminomethane 三搓甲基氨基甲炕.3. 10 DEPC 焦碳酸乙二醋。2 3. 11 3. 12 Taq酶Taq DNA聚合酶。UNG酶uracil DNA glycosylase 尿暗晓DNA-糖基酶。4 生物安全措施SN/ T 1869- 2007 为了保护实验室人员的安全

9、，应由具备资格的工作人员检测沙门氏菌，所有培养物和废弃物应小心处置.并按GB19489中的有关5 防污染措施6 试剂和材料除另有规定外，所有试剂均果6. 1 水:应符合GB/T6682中6. 2 DNA提取液:主要成分是6.3 10XPCR缓冲液其中氯化6. 4 UNG酶。6. 5 琼脂糖。6.6 10X上样缓冲液:含0.256. 7 50XTAE缓冲液:称取溶于水中，定容至2L。分装后6.8 DNA分子量标记物(1006. 9 Eppendorf管和PCR反6.10 mLST-Vm肉汤:阪崎肠6. 11 BHI肉汤:阪崎肠杆菌捡230)中第6章污染的预防和控制。3) : 100 mmol/L

10、;明胶:O.l%J。0. 5 mol/ L EDTA (pH : 8. 0) , 6. 12 常见致病菌(沙门氏菌、志贺洞哩E嗣球菌曹肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、空肠弯曲菌、肠出血性大肠埃希民菌0157: H7、副溶血性弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌)普通PCR检测试剂盒2)(试剂盒组成、功能及使用注意事项参见附录盼。6. 13 BAX(J!)沙门氏菌的PCR检测试剂盒(Qualicon# 17710608，试剂盒组成参见附录C)，5:土3(;放置。6. 14 BAX单核细胞增生李斯特氏菌PCR检测试剂盒(Qualicon特17710609)，5:土3C放置。6.15 BAX弯曲菌的PC

11、R检测试剂盒(Qualicon# 17720680) ，5C土3C放置。6.16 BAX系统肠出血性大肠杆菌0157: H7多重(MP)PCR筛选试剂盒(Qualicon# 17720673)。6.17 BAX系统肠出血性大肠杆菌0157: H7 (MP) PCR快速检测增菌培养基(Qualicon# 17710678，17710679)。2)由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可.如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品.3 SN/T 1869-2007 6. 18 BAX阪崎肠杆菌的PCR检测试剂盒(Qualicon梓17720657)，

12、5C士3C放置.7 仪器和设备7.1 PCR仪.7.2 电泳装置。7.3 凝胶分析成像系统。7. 4 PCR超净工作台.7.5 高速台式离心机离心转速12000 r/min以上)，台式离心机(离心转速2000 r/ min). 7.6 微量可调移液器(2L、10L、100L、1000L). 7.7 BAX4全自动致病菌检测系统(启动包)。第一法普通PCR法8 检测程序普通PCR方法检测程序见图10样品制备法事罪蚀.肉汤就传签定的商株细茵DNA的提取PCR扩增图1PCR检测致病菌程序固9 操作步骤9. 1 样晶制备、增菌培养和分离9. 1. 1 沙门氏菌按照GB/T4789.4或SN0170或I

13、SO6579或FDA/BAMChapter5或USDA/FSISMLG4C.01方法进行。9. 1.2 志贺氏菌按照GB/T4789. 5方法进行。9. 1.3 金黄色葡萄球菌可按照GB/T4789. 10或SN0172方法进行。9. 1. 4 小肠结肠炎耶尔森氏菌可按照GB/T4789.8或SN0174方法。SN/ T 1869- 2007 9. 1. 5 单核细胞增生李斯特氏菌可按照GB/T4789. 30或SN0184或ISO11290或FDA/BAMChapter 10或USDA/FSISMLG8A. 01方法进行.9. 1.6 空肠弯曲菌按照GB/T4789. 9或SN0175方法进

14、行。9. 1.7 肠出血性大肠埃希氏菌0157: H7按照GB/T4789. 6或SN/T0973或ISO16654方法进行.9. 1.8 副溶血性弧菌按照GB/T4789.7或SN0173或FDA/BAMChapter 9或NMKLNo.156方法进行.9. 1. 9 霍乱弧菌按照SN/T1022或FDA/BAMChapter 9或NMKLNo.156方法进行.9. 1. 10 创伤弧菌按照FDA/BAMChapter 9或NMKLNo.156方法进行。9. 2 细菌模板DNA的提取9. 2. 1 直接提取法对于上述方法培养的增菌液，可直接取该增菌液1mL加到l.5 mL无菌离心管中，800

15、0 r/min离心5min.尽量吸弃上消;加入50LDNA提取液参见附录B)，混匀后沸水浴5min, 12 000 r/01in离心5min，取上消保存于-20C备用以待检测。一70C可长期保存.对于9.1方法分离到的可疑菌落，可直接挑取可疑菌落，加入50LDNA提取液，再按照上述步骤制备模板DNA以待检测。9. 2.2 有机溶剂攫纯法取待测样本(增菌培养液或分离菌落菌悬液)1mL，加到1.5mL离心管中，8000r/min离心4min , 尽量吸弃上清;加入750LDNA提取液，沸水浴5min，加酣:三氯甲烧(1: 1，体积比)700L.振荡棍匀，13000 r/min离心5min，去上清液

16、，70%乙醇冲洗一次，13000r/min离心5rnin，沉淀溶于20L核酸溶解液中.保存在一20.C备用。一70C可长期保存。也可使用等效的商业化的DNA提取试剂盒并按其说明提取制备模板DNA.9. 3 PCR扩增9.3. 1 号|物的序列引物的序列见附录A.9.3.2 空白对照、阴性对照和阳性对照设置空白对照设为以水代替DNA模板;阴性对照采用非目标菌的DNA作为PCR反应的模板;阳性对照采用含有检测序列的DNA(或质挝作为PCR反应的棋板。9. 3. 3 PCR反应体系普通PCR反应体系见表1.表1普通PCR反应体系试剂贮备浓浓度25L反应体系中加样体积/L10XPCR缓冲液一2.5 民

17、化楼(MgClz)25 mmol/ L 3. 0 dNTP.(含dUTP)各2.5mmol/L 1. 0 UNGM 1 U/L 0.06 上游引物1. 0 20 pmol/L 下游引物1. 0 Taq酶5 U/L O. 5 DNA模板一2. 0 双蒸水一补至25注1:反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整.注2:每个反应体系应设置两个平行反应. 5 SN/ T 1869-2007 9.3.4 PCR反应参数PCR反应参数见附录A。9.3.5 PCR扩增产物的电泳检测用电泳缓冲液(1XTAE)制备1.8%-2%琼脂糖凝胶(55C-60.C时加入漠化乙键至终浓度为0.5g

18、/mL，也可在电泳后进行染色。取8L-15LPCR扩增产物，分别和2L上样缓冲液混合，进行点样，用DNA分子量标记物做参照。3V / cm-5 V /cm恒压电泳，电泳20min-40 min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。10 结果判定和报告在阴性对照未出现条带，阳扩增条带，则可报告该样品检假定阳性，则回到传统的检测步果以后者的检测结果为准。11 适用范围BAX01全自动致病菌PCR检菌、肠出血性大肠埃希氏菌0157: H 7 12 原理BAX全自动致病菌检测系扩增反应开始，BAXQ系统扩增反应后，BAXQ系统开始检阳性或阴性结果。13 检验程序13. 1 沙门氏菌、单核细胞增生

19、李参见图l(没有电泳步骤)。13.2 BAX阪崎肠杆菌PCR方法检测程序见图2.14 操作步骤14. 1 样品增菌.下，如待测样品未出现相应大小的扩增条带则可判定该样品结果为标准检测方法进行确认，最终结细胞增生李斯特氏菌、空肠弯曲的自动方法。A结合，光照时发出荧光信号。测来分析PCR产物，从而得到大肠埃希氏菌0157: H7检测程序14. 1. 1 沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、空肠弯曲菌的样品制备、增菌培养和分离见9.1.14. 1. 2 肠出血性大肠埃希氏菌0157: H7增菌方法按照BAXQ系统0157: H7增菌培养基用户指导书进行。14. 1.3 阪崎肠杆菌增菌:以无菌操作称取2

20、5g样品，放人装有.225mL mLST-Vm肉汤中，混匀，在45.C土0.5.C培养箱内培养20h-22 h;取10L上述增菌液加入500L的BHI肉汤中，36.C土1.C培养3h。SN/ T 1869-2007 14.2 细菌模植DNA的制备沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、空肠弯曲菌、肠出血性大肠杆菌0157: H7和阪崎肠杆菌增菌肉汤或菌落的细菌模板DNA的制备按各自BAXQ系统筛选的PCR分析试剂盒说明书进行。14. 3 BAX系统致病菌的检测按照BAX用户指导书来准备试剂，进行检测和读取结果.检样固2BAX阪崎肠杆菌PCR方法栓测程序15 结果说明白.1BAX检测结果为阴性的样品可

21、以出具阴性报告。15.2 检测结果显示为阳性的样品需要继续按照传统的方法进行确认。15.3 检测结果显示为不确定或错误时，用BAXQ系统重新进行检测.军主glMOO斗附录(规范性附录PCR检测的靶基因、引物序列和反应参鼓A 。PCR检测的靶基因、引物序列和反应参数表扩增片段PCR反应条件致病菌靶基因名称引物列长度预变性扩用循环数后延伸95C, 30 s 抄门氏商nvA 5 -gtg aaa tta tcg cca cgt tcg ggc aa-3 284bp 95C ,5 min 64C ,30 s 35 72C, 5 mio 5 -tca tcg cac cgt C8a agg aac c-

22、3 72C . 30 s 95 C . 15s 志贺氏菌iaH 5 -gtl cct tga ccg cct ttc cga t8C cgt c -3 629bp 95C . 5 min 65C ,30 s 35 72C ,5 min 5 -gcc ggt cag cca ccc tct gag 8gt ac -3 72C . 30 s 94 C . 2 min 金黄色葡萄球菌femA 5 -aa8 aaa gca cat aac aag cg-3 132bp 94C, 5 min 57C , 2 min 35 72C .7 min 5 -gat aaa gaa gaa 8CC agc 8g

23、-3 72C,) min 95 C ,30 s 小肠结肠炎耶尔森氏菌6 s 5 -aal acc gca taa cgl ctt cg -3 330bp 95C , 5 mi n 52 C, min 35 72 C , 5 mi n 5人Ctlctt ctg cga gta acg lC -3 72C, 1 min 5 -gat aca gaa aca tcg gtt ggc -3 95 C ,30 s 单增李斯特氏菌rJA 274bp 95 C, 5 min 55 C ,30 5 35 72.C ,5 min 5 -gtg taa tct tga tgc cal cag -3 74 C,1

24、min 5-gat atg ta t gat ftt afC ttg c -3 95C ,30 s 空肠弯曲杆菌VSl 358bp 95 C, 5 min 56 C . 30 s 35 72C . 5 min 5 -gaa tga aat tlI aga atg ggg -3 72 C, 30s 表A.lZ主g-NOO吨表A.t (续)扩增片段PCR反应条件致病菌靶基因名称引物序列长度预变性扩增循环数后延伸. 95t ,15s 肠出血性大肠埃希氏菌5 -att gcg ctg aag cct ltg-3 499bp 95t , 5 min 55.C ,30 s 35 72t.5 min rJb

25、E 0157 :日75 -cga gta cal tgg cat cgt g-3 72t.1 min 95t ,1 mi n 5人aaagcg gat lat gca gaa gca ctg -3 450bp 95t , 5 min 60t ,1 min 35 72t.5 min 副海血性弧菌tlh 5-gct act tlc tag cat ttt ctc tgc -3 72t.2 min 95t ,30 s 5-cac caa gaa ggl gac tlt att gtg-3 588bp 95t , 5 min 64t ,30 s 35 72t , 5 min 霍乱弧菌ompW 5 -g

26、aa ctt ata acc acc cgc g-3 72t ,30 s 95t , l min 5 -ccg cgg tsc agg t tg gcg-3 519bp 95t , 5 min 62t , 1 min 35 72t , 5 min 创伤弧菌vvhA 5 -cgc cac cca Ctl tcg ggc c -3 72t ,1 min 注:PCR反应参数可根据基因的扩增仪型号的不同进行适当的调整。2 SN/ T 1869-2007 附录B资料性附录致病菌普通PCR检测试剂盒B. 1 试剂盒组成每个试剂盒(每个反应体系体积为25L)成分见表B.L表B.l试剂盒成分B. 2.1 PC

27、R反应液中含有特异性寻B. 2. 2 核酸溶解液是去离子水，用B.3 使用注意事项B. 3.1 严格执行行业行政主管部门颁B. 3. 2 本试剂盒仅用于体外检测，B. 3. 3 试剂盒内各试剂使用前，注意检查各反应管是否盖紧，以免组成成分PCR反应液Taq酶UNG酶阳性对照阴性对照B. 2 说明格L 1管22啤管理规范。前要仔细阅读本说明书全文。应尽量避免产生气泡，上机前附录C(资料性附录BA全自动致病菌PCR检测试剂盒组成以沙门氏菌为例(产品序列号17710608;96个测试C. 1 PCR片剂SN/ T 1869-2007 2袋，每个PCR管中一个片剂，12个八联管。片剂包括检测反应和内置

28、阳性对照反应所需的试剂(有了内置阳性对照不需另设质控反应。片剂重7.6mg土0.1mg。C.2 PCR管盖1袋，12个八联管益。C.3 裂解缓冲液2瓶，12mL/瓶;pH8.35土O.05 (25OC ) t用于制备工作裂解液。C. 4 蛋白酶溶液1瓶，400L/瓶。用于制备工作裂解液。SN/T 1869-2007 附景D(资料性附录培养基D.1 改良月桂基硫酸盐膜蛋白陈肉汤(mLST-Vm)D. 1. 1 成分膜路陈20.0 g 氯化饷34. 22 g 乳糖5.0 g 磷酸氢二饵2.75 g 磷酸二氢饵2.75 g 月桂基硫酸锅0.1 g 万古霉素0.01 g 蒸馈水1 000.0 mL D

29、. 1.2 制法除万古霉素外将各成分加人蒸馆水中，加热溶解，调节pH至6.8士O.20 1210C高压灭菌15mino 万古每索配成10mg/mL的溶液，用O.2m的滤膜过滤除菌.临用时，取1mL万古霉素溶液加到1 000 mL mLST中。D. 2 BHl肉汤D. 2. 1 成分领牛脑200. 0 g 牛心250.0 g 多价蛋白陈10.0 g 葡萄糖2.0 g 氯化锅5.0 g 磷酸氢二纳2. 5 g 蒸偏水1 000.0 mL D. 2. 2 制法将除去结缔组织并绞碎的棋牛脑和牛心肌分别加水各500mL，搅拌，放入40C左右冰箱过夜，次日取出，分别加热至60t-70t约30min，再煮沸约1h，搅拌并补充蒸发水分，防止沉渣烧焦.用纱布过滤，再将两液混合于同一容器，并补充水分至1000 mL，加入其他成分，适当加热使完全溶解，调节pH至7.4土0.20再适当加热后过滤，分装，121c灭菌15mino 书号:155066 2-17798 ClI / T 喃自cn_nl. 吨.n、