SN T 1872-2007 出入境口岸霍乱弧菌多重聚合酶链反应操作规程.pdf

1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1872-2007 出入境口岸霍乱弧菌多重聚合酶链反应操作规程Examination codes of multiplex PCR for Vibrio cholere at entry-exit ports 2007-04-06发布2007-10-16实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局SN/T 1872-2007 目。昌本标准的附录A为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中国CDC传染病预防控制所、中华人民共和国广西出入境检验

2、检疫局、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人:杨泽、朱海、|润舰、涂承宁、景怀琦、林继;!:l、刘洪文、杜联峰、谭勇、叶立青、谭华、王岚。本标准为首次发布的出入境检验检疫行业标准。1 范围出入境口岸霍乱弧菌多重聚合酶链反应操作规程本标准规定了出入境口岸霍乱弧菌多重PCR检验的对象、检验程序及结果报告。SN/T 1872-2007 本标准适用于霍乱弧菌菌株的霍乱肠毒素基因的检验。直接自标本或其增菌液中进行。1群和0139群霍乱弧菌的检测筛查也可参照(参考)使用，以提示进行进一步的菌株分离。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，

3、其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB 15984 霍乱诊断标准及处理原则GB 19489 实验室生物安全通用要求S:-.J /T 1239 国境口岸霍乱检验规程WS/T 230 临床诊断中聚合酶链反应CPCR)技术的应用3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1 聚合酶链反应polymerase chain reaction , PCR 在体外用于扩增位于两段已知序列(引物)之间的D:-.JA区

4、段的方法。3.2 多重PCRmultiplex PCR 在同一试管中加入多对引物、在一个反应过程中扩增同一模板的几个目标基因片段。4 缩略语4.1 4.2 4.3 下列缩略语适合于本标准。VC Vibrio Cholerae 霍乱弧菌。ctxA Cholera enterotoxin A 霍乱弧菌肠毒素AotoxR Central regulatory protein ToxR 中心调节蛋白。SN/T 1872-2007 4.4 4.5 4.6 4. 7 4.8 4.9 4.10 4.11 4.12 4.13 PCR polymerase chain reaction 聚合酶链反应。dNTP

5、deoxyribonucleoside triphosphate 脱氧核昔三磷酸。dA TP deoxyadenosine triphosphate 脱氧腺昔三磷酸。dGTP deoxyguanosine triphosphate 脱氧鸟昔三磷酸。dCTP deoxycytidine triphosphate 脱氧胞昔三磷酸。dTTP deoxythymidine triphosphate 脱氧胸昔三磷酸。SDS sodium dodecyl sulfate 十二皖基硫酸纳。Tris tris Chydroxymethyl) aminomethane 三(起甲基)氨基甲:境。Taq酶TaqDN

6、A polymerase T叫DJA聚合酶。PBS phosphate-buffered saline 磷酸盐缓冲液。5 对象5.1 霍乱弧菌菌株。5.2 霍乱感染病例、霍乱感染嫌疑人的排泄物、呕吐物及其增菌液。5.3 被霍乱弧菌污染或有霍乱弧菌污染嫌疑的水生动物、食品、饮用水、压舱水和环境样本及其增菌液。6 检验程序6.1 准备6.1.1 实验室准备检验设备和材料，所需设备和材料参见附录A。实验室生物安全符合GB19489和人间传染的病原微生物名录的规定。PCR防污染措施按WS/T230要求。6.1.2 对所采集的样本应进行标志，标志应具唯一性。6.2 实验室检验6.2.1 样品采集、增菌培

7、养和细菌分离鉴定按照GB15984和SN/T1239相关标准进行。6.2.2 用于细菌DNA提取的样本的前处理6.2.2.1 霍乱弧茵茵株的处理SN/T 1872-2007 用无菌环从平板上取四分之一个到1个纯菌落的菌量，混悬于100L的纯水中。模板提取见6.2. 3 0 取纯菌的LB或碱性蛋白陈增菌液1mL加到1.5 mL离心管中，以12000r/min离心2min集菌，去上清液，用1mL生理盐水或pH7.4的PBS洗一遍，8000 r/mi口离心5min，尽量吸干上清;沉淀物用于模板提取见6.2.306.2.2.2 粪便和呕吐物样本的直接处理直接从粪便和呕吐物样本中提取模板时，可取水样粪便

8、或呕吐物约200L或200mg，用1mL PBS(pH7.4)悬浮，2000 r/mi口离心5min，收集上清液于1.5 mL离心管，10000 r/min离心5min，尽量吸干上清液;沉淀物用于模板提取见6.2.3。同时，可对上述收集的粪便上清液进行1: 10倍的连续稀释2次，10000 r/min离心5mi口，尽量吸干上清液;沉淀物用于模板提取见6.2.30并将粪便的3种稀释样本的D:-.JA模板分别进行PCR检测。6.2.2.3 水样直接的处理将100mL500 mL水样用o.2m滤膜过滤，取滤膜悬浮于1mL5 mL蒸馆水中，振荡?昆匀。样本可采用不稀释、1: 20稀释和1: 100稀释

9、的方法进行PCR检测。取1mL样品以12000 r/min离心2min集菌，去上清液，沉淀物用于模板提取见6.2. 3 0 6.2.2.4 增菌液的处理所有样本均可按照GB15984和SN/T1239相关标准方法进行增菌，取增菌液1mL加到1.5 mL 离心管中，以12000 r/mi口离心2min集菌，去上清液，用1mL生理盐水或pH7.4的PBS洗一遍，8 000 r/min离心5mi口，尽量吸干上清液;沉淀物用于模板提取见6.2. 3 0 进行霍乱弧菌的监测时宜采用增菌法，用增菌液提取扩增模板。6.2.3 模板DNA制备6.2.3. 1 加热处理法在沉淀物中加入50L100L超纯水，振荡

10、泪匀，100C煮沸10min, 12 000 r/mi口离心5min，上清液即为扩增模板。上清液转移并保存在200C备用，-70oC可长期保存。6.2.3.2 酣-氯仿DNA提取法在沉淀物中加入700LD:-.JA提取液，100oC煮沸10min，加酣:三氯甲:民(1:1，体积比)700L，振荡?昆匀，12000 r/min离心5mi口，取上清液至另一离心管中，加入等量元水乙醇沉淀D:-.JA，12 000 r/mi口离心5min，去上清液，再加入1mL的70%乙醇冲洗一次，12000 r/min离心5mi口，去上清液，室温晾干，加入50L100LTE液(或核酸溶解液)溶解沉淀，即为扩增模板。

11、保存在一200C备用，-70oC可长期保存。6.2.3.3 试剂盒提取纯化DNA法按适用于细菌基因组提取的试剂盒说明书操作。6.2.4 PCR检验6.2.4. 1 原理选择和扩增霍乱弧菌的肠毒素基因(ctxA)、中心调节蛋白基因(toxR)、01群和0139群特异性基因的靶序列各设计1对特异性引物，通过PCR技术，扩增出特异性片断，判断相应基因的存在。6.2.4.2 引物和扩增产物各基因的PCR检测使用以下引物:3 SN/T 1872-2007 ctxA , 5 -CGG GCA GA T TCT AGA CCT CCT G-3 5-CGA TGA TCT TGG AGC ATT CCC AC

12、-3 (扩增片断长度:564bp)toxR:5-CCT TCG ATC CCC TAA GCA ATA C-3 5-AGG GTT AGC AAC GAT GCG TAA G-3 (扩增片断长度:779bp)v. chulere 01:5-GTT TCA CTG AAC AGA TGG G-3 5 -GGT CAT CTG TAA GTA CAA C-3 (扩增片断长度:192bp) V. chulere 0139:5-AGC CTC TTT ATT ACG GGT GG-3 5-GTC AAA CCC GAT CGT AAA GG-3 (扩增片断长度:449bp)以上4对引物可根据工作的需要

13、进行组合使用，如只选用1对引物进行扩增，PCR反应体系按照WS/T 230要求进行。6.2.4.3 阴性对照、阳性对照设置阴性对照设为PCR反应的空白对照(以超纯水代替DNA模板)，阳性对照采用含有检测序列的DNA(或质粒)作为PCR反应的模板。6.2.4.4 多重PCR反应体系每个样品做2个平行管，多重PCR反应体系如下:10XPCR缓冲液5L;25 mmol/L氧化娱(MgC12)4L; dNTP叫每种d:-.JTP终浓度为O.2 mmol/L) 1L; 引物(每种引物浓度为20mol/L)1L; 1叫酶(5U/L)0.5L; 模板DNA3L;超纯水补足至50L，如果所用扩增仪没有热盖，可

14、在每管中加石蜡油1滴。以上反应体系中氧化娱(MgC12)、d:-.JTP、丁qDNA聚合酶和引物的终浓度可根据各实验室使用试剂的不同做适当调整，以达到最佳反应体系。6.2.4.5 多重PCR反应程序循环参数为:94C4 mi口，变性模板;然后94C1 min, 55C 1 min, 72C 1 mi口，30个循环;72C延伸口m nu ti PCR反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整。6.2.4.6 PCR扩增产物的电泳检测用电泳缓冲液(lXTAE或0.5XTBE)制备2%琼脂糖凝胶(55C60C时加入漠化乙链至终浓度为O.5g/mL，也可在电泳后将凝胶浸在含O.5g/mL澳化乙链

15、的电泳缓冲液或水中，于室温30 min45 min进行染色)。取9LPCR扩增产物与1L上样缓冲液混匀后上样，同时以DNA分子量标记物做参照。电泳时，电压大小一般控制在3V / cm 5 V / cm，电泳缓冲液为1X TAE或0.5XTBE，电泳时间根据PCR扩增片断长度及澳酣蓝的移动位置来确定，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存或用紫外检测仪观察和记录。6.2.4.7 检验结果判断及意义阴性对照未出现条带，阳性对照出现所有预期大小的扩增条带，则实验有效，否则应重新做实验，并排除污染因素。待测样品如在某预期片段大小位置上出现扩增条带，则可判定该样品相应的基因为阳性;如果待测样品未出现预

16、期大小的扩增条带，则可报告该样品中未检出预期大小的基因片断。ctxA基因片断阳性，报告为检出ctxA基因片断(564bp)toxR基因片断阳性，报告为检出toxR基因片断(779bp)01群霍乱弧菌基因片断阳性，报告为检出01群霍乱弧菌基因片断(l92bp)0139群霍乱弧菌基因片断阳性，报告为检出0139群霍乱弧菌基因片断(449bp)4 SN/T 1872-2007 注L按6.2.2.2或6.2.2.3或6.2.2.4进行的检测，待i则样品如在某预期片段大小位置上出现扩增条带，只表示所检样品中含某种基因片断，并不表示该样品中检出霍乱弧菌。注2:最小弧菌(也称拟态弧菌，V巾-iomimicu

17、s)也可出现上述某些扩增基因片断。检测结果意义如下:在霍乱弧菌菌株中检测到ctxA基因片断，表明该待测霍乱弧菌菌株含ctxA基因，该菌株是一产毒菌株。在非霍乱弧菌菌株的样品中检测到预期大小的扩增条带，只能说明从该待测样品中检测到某种预期大小基因片断，提示可能有相对应的霍乱弧菌存在(见表1)，应对该样品做进一步的分离鉴定，霍乱弧菌分离鉴定按GB15984和SN/T1239相关标准的方法进行。表1霍乱弧菌PCR检测结果分析表检测基因可能出现的lCR带型ctxA 十+ 十01群+ 十0139 十十toxR 十+ + 十十十参考结果产毒非01非不产毒非01非产毒01群不产毒01群产毒0139群不产毒0

18、139群0139在手VC0139在手VCVC VC VC VC 5 SN/T 1872-2007 附录A(资料性附录)试剂、材料和仪器设备A.1 试剂和材料A.1.1 除另有规定外，所有试剂均采用分析纯OA. 1.2水应符合GB/T6682中一级水的规格。用于PCR的水要使用超纯水。A. 1. 3 D:-.JA提取液称取5g SDS榕于1000 mL TE液中，高压灭菌备用。A. 1. 4 10 X PCR缓冲液包括:氯化饵(KCl):500 mmol/L;Tris-HCl(pH8. 3): 100 mmol/L;明胶:0.1%, A. 1. 5 PCR反应液含氧化娱(MgC12)的PCR缓冲

19、液、dATP、drl、P、dCTP、dGTP、丁叫酶OA. 1.6 琼脂糖A. 1. 7 10X上样缓冲液含0.25%澳酣蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油水溶液。A. 1. 8 50XTAE缓冲液称取484g Tris，量取114.2mL冰乙酸，200mL O. 5 mol/L EDTA(pH8. 0)，溶于超纯水中，定容至2L，分装后高压灭菌备用。A. 1.9 5XTBE电泳缓冲液称取54g Tris , 27. 5 g棚酸，20mL O. 5 mol/L EDTA(pH8. 0)，定容至1L , A. 1. 10 1:臭化乙链(10mg/mL) 在100mL超纯水中加入1g漠化乙链，

20、至完全溶解，转移至棕色瓶中，保存于室温OA. 1. 11 0.5 mol/L EDTA(pH8. 0) 在800mL超纯水中加入186.1 g二水乙二肢四乙酸二纳，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用氢氧化纳(:-.JaOH)调节溶液pH值至8.0，然后定容至1L，分装后高压灭菌备用。A. 1. 12 TE缓冲液(pH7.4)0.1 mol/L Tris-HCl(pH7. 2) 20 mL加入0.5mol/L EDTA(pH8. 0) 40 mL，用超纯水定容至200 mL，高压灭菌后4C保存。A. 1. 13 D:-.JA分子标记物(100bp 1 000 bp) A. 1. 14 PCR引物应为色谱

21、纯。A. 1. 15 阳性菌株或质粒与相应PCR引物匹配。A.2 仪器设备A. 2.1 PCR仪。A. 2. 2 电泳装置。A. 2. 3 紫外检测仪或凝胶分析成像系统。A. 2. 4 生物安全柜。6 A. 2. 5 高速台式离心机(最高离心力12000 g以上)0 A. 2. 6 台式离心机(最高离心力2000 g以上)。A. 2. 7 微量可调移液器(2L、10L、100L、1000L)三套和相应吸头。SN/T 1872-2007 khCON-Nh-问Z中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出入境口岸霍乱弧菌多重聚合酶链反应操作规程SN/T 1872-2007 中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045-兴网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷当咛开本880X 1230 1/16 印张o.75 字数13千字2007年7月第一版2007年7月第一次印刷印数1-2000 定价8.00元-兴书号:155066 2-17801 SN/T 1872-2007