DB33 T 752-2009 植物种苗组培快繁技术规程.pdf

1、 ICS 65.020.20 DB33B05 备案号： 浙江省地方标准DB33/T 7522009植物种苗组培快繁技术规程 Technical regulations for plant micropropagation 2009-08-10 发布 2009-09-10 实施浙江省质量技术监督局发布DB33/T 7522009 I 目 次 前 言 . II 1 范围 . 1 2 术语和定义 . 1 3 组培工厂的设计要求、所需的仪器设备及化学试剂 . 1 4 组培苗生产流程 . 2 5 培养容器和接种器械的清洗 . 2 6 培养基的配制 . 3 7 消毒灭菌操作 . 4 8 培养材料和外植体灭

2、菌 .4 9 接种操作 . 5 10 培养室操作 . 6 11 组培苗移栽和组培穴盘苗生产 . 7 12 质量标准 . 8 13 包装、标志、运输 . 8 附 录 A （资料性附录） 常用植物组培术语和定义 . 9 附 录 B （资料性附录） 植物组培苗生产流程图 . 12 附 录 C （资料性附录） 组培工厂设计、所需面积及设计要求 . 13 附 录 D （资料性附录） 组培工厂所需的仪器设备 . 14 附 录 E （资料性附录） 组培工厂所需的玻璃器皿及器材 . 16 附 录 F （资料性附录） 常用基本培养基成分表 . 18 附 录 G （资料性附录） 植物组培常用化学试剂、药品一览表

3、. 20 附 录 H （资料性附录） MS 培养基母液配配制表 . 23 附 录 I （资料性附录） 常用植物生长物质的母液配制 . 24 DB33/T 7522009 II 前 言 本标准的附录A 、附录 B、附录 C、附录 D、附录 E、附录 F、附录 G、附录 H、附录 I均为资料性附录。 本标准由浙江省农业厅提出并归口。 本标准起草单位：浙江省农业科学院。 本标准主要起草人：陈剑平、徐刚、K.B.Kumar 、汪一婷、吕永平、牟豪杰。 DB33/T 7522009 1 植物种苗组培快繁技术规程 1 范围 本标准规定了植物种苗的组培快繁的术语和定义、组培工厂的设计要求、所需的仪器设备及化

4、学试剂、组培苗生产流程、培养容器和接种器械的清洗、培养基的配制、消毒灭菌、培养材料和外植体灭菌、接种操作、培养室操作、组培苗移栽和穴盘苗生产、质量标准及包装、标志、运输等内容。 本标准适用于植物种苗的组培快繁技术规程管理的全过程。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。常用植物组培术语和定义参见附录A 。 2.1 组培苗 plantlet 利用植物器官等作为外植体，采用植物组织培养技术生产的种苗。 2.2 琼脂苗 in agar plantlet 在培养容器中带琼脂的组培生根苗。 2.3 无琼脂苗 ex agar plantlet 从培养容器中取出并洗去琼脂后的组培生根苗。 2.4 组培

5、穴盘苗 plug plant 移栽在穴盘中培育的组培生根苗。 3 组培工厂的设计要求、所需的仪器设备及化学试剂 3.1 设计要求 3.1.1 组培工厂应建在排水设施良好，常年主风向的上风区。应远离各种污染源（如粉尘大的工厂、微生物工厂和繁忙交通干道），周边环境应干燥、安静、通风透光、空气清新。 3.1.2 组培工厂新建建筑地基应高出地面 30 cm 以上，楼顶不应有渗漏；若建两层或三层，宜安装简单载物电梯；准备室、洗涤室、培养基配制室、灭菌室宜安排在楼下，接种室、培养室应防潮、隔热保温，宜安排在二楼、三楼。 3.1.3 组培工厂各分区要布局合理，应根据生产工艺流程（参见附录 B 植物组培苗生产

6、流程图），把各部分安排成一条连续、有序和通畅的生产流水线。 3.1.4 利用办公室、仓库等旧房进行改造的组培工厂，应合理安排，做到杜绝污染，方便工作，节省能源，使用安全。 3.1.5 组培工厂设计包括组培车间：洗涤室、培养瓶晾干室、药品室（称量室）、培养基配制室、灭菌室、培养基储存室、更衣室、接种室、培养室、出苗室和贮物室；办公生活区：办公室、工作人员室和其它生活空间等；大棚温室：母本圃、组培苗驯化区、组培苗移栽圃和辅助用房等。 3.1.6 不同规模组培工厂设计、所需面积及设计要求参见附录 C。 3.2 仪器设备及化学试剂 DB33/T 7522009 2 3.2.1 植物组培所需的仪器设备包

7、括灭菌设备、培养设备和培养容器、实验设备、办公用品和消防灭火设备等。不同规模组培工厂所需的仪器设备参见附录 D。 3.2.2 组培所需的玻璃器皿及器材包括盛装器皿（烧杯、试剂瓶等）、计量器皿（量筒、容量瓶等）以及其他常用消耗品等。不同规模组培工厂所需的玻璃器皿及器材参见附录 E。 3.2.3 常用化学试剂包括组培苗生产所用基本培养基所需的无机盐类和有机物类。常用基本培养基成分参见附录 F。组培中常用的无机盐类、有机物类、植物生长物质、消毒剂、洗涤剂等参见附录 G。 4 组培苗生产流程 4.1 生产流程图 植物组培苗生产流程参见附录B 。 4.2 新品种引进、母本圃种植 将引进的新品种植株种植在

8、温室内，加强肥水管理，确保植株健壮，防治病虫害，减少植株表面附带的微生物和害虫。 4.3 材料选择 从具有品种典型性状的健康植株上选择芽、茎或叶等植物材料作为外植体。 4.4 外植体灭菌 参见8.3 外植体灭菌的方法将取得的外植体进行表面灭菌。 4.5 初代培养 在无菌滤纸上将表面灭菌处理后的外植体切割成所需大小，一般约为0.5 cm 0.5 cm 0.5 cm 大小，接入初代培养基中进行培养。外植体初代培养20 d 40 d后，一般可诱导出幼芽。 4.6 增殖培养 将初代培养诱导形成的幼芽或丛生芽，转接到增殖培养基中进行培养。增殖培养周期根据培养材料及组培苗生长情况而定，一般培养周期为30

9、d 60 d；增殖培养代数控制在16代 24代以内，繁殖系数控制在2.5 4.0。 4.7 壮苗培养 将增殖的丛生芽接种到壮苗培养基中， 培养20 d 30 d 后幼苗株高可生长达2 cm 5 cm 。 4.8 生根培养 从壮苗培养的幼苗中切取生长健壮、叶色正常、叶片舒展、适于生根的无根苗，接种在生根培养基中进行培养，培养20 d 30 d后幼苗基部长出数根新根。 4.9 组培苗炼苗移栽 组培苗炼苗3 d7 d后移入含蛭石、泥炭、珍珠岩等基质或混合基质的穴盘中。 4.10 穴盘苗生产管理 穴盘苗在温室大棚中进行光、温、水、肥等管理，培育2 个月 3个月，穴盘苗可长至10 cm 15 cm高。

10、4.11 出苗、包装、运输 按本标准第13 章 包装、标志、运输的方法将琼脂苗、无琼脂苗和组培穴盘苗经包装后出售。 5 培养容器和接种器械的清洗 5.1 培养容器的清洗 5.1.1 浸泡：新的培养容器（培养瓶、培养皿和试管等）直接放入洗洁精或洗衣粉溶液中浸泡；用过的培养容器须先倒掉瓶中的培养基后再浸泡；污染的培养容器应先按 7.1 的要求进行高压灭菌，然后倒掉瓶内污染物再浸泡；浸泡时间不应少于 6 小时，一般为过夜。 5.1.2 洗刷：用瓶刷洗刷瓶内残留的培养基和瓶外的灰尘。 5.1.3 冲洗：将培养容器用自来水冲洗 3 遍5 遍。 DB33/T 7522009 3 5.1.4 晾干：把冲洗干

11、净的培养容器倒放在培养容器专用框中晾干。 5.1.5 清洁标准：晾干的培养容器内外壁无明显的斑点、污迹。 5.2 接种器械的洗刷 5.2.1 清理：清除接种器械（镊子、解剖刀柄、不锈钢碟等）上残留的培养基和培养材料。 5.2.2 清洗：在洗洁精溶液中浸泡数分钟，用钢丝球洗刷后用清水冲洗 3 遍 5 遍。 5.2.3 灭菌：用棉布或纸等包好接种器械，按 7.1 进行高压灭菌。 5.2.4 玻璃器皿应小心轻放，避免打碎划破手。移取烫手的器械时应戴隔热手套（如棉手套或石棉防火手套）。若发生意外参见相关实验室安全规程处理。 6 培养基的配制 6.1 培养基选择 根据培养材料生长发育特性选择合适的基本培

12、养基种类和激素配比（常见基本培养基成分参见附录F）。 6.2 化学试剂的选择和保存 6.2.1 应符合附录 G 所要求的试剂级别。 6.2.2 应标签完整，并在有效期内使用。 6.2.3 每瓶试剂在使用前目测应无异物异色。 6.2.4 应严格按规定的温度存放。 6.3 基本培养基母液的配制和保存 6.3.1 制作培养基前需先配制基本培养基母液，MS 基本培养基母液配制比例参见附录 H，其它基本培养基母液配制比例可参考本方法。 6.3.2 母液配制应用去离子水。 6.3.3 母液保存要求：母液保存应置于 4 左右的冰箱内。母液保存期应不超过 15 天。 6.3.4 母液容器上应贴好标签，注明名称

13、、配制日期，发现标签不明或母液中有沉淀、浑浊或变色现象应停止使用。 6.4 植物生长物质的母液配制 6.4.1 植物生长物质的母液配制浓度 0.1 mg/mL1.0 mg/mL ，植物生长物质的母液配制方法参见附录I。 6.4.2 植物生长物质的母液保存要求：母液配制好后贴好标签，按规定要求保存，保存期应不超过 2个月。 6.5 培养基制作 6.5.1 准备：根据培养基成分准备好去离子水、琼脂、蔗糖和各类母液等。 6.5.2 琼脂融化：加去离子水 700 mL（按所需容量的 70%左右），再加入琼脂 5 g9 g，加热搅拌使琼脂融化。 6.5.3 糖溶解：琼脂融化后，加入蔗糖 30 g，稍加热

14、使糖溶解。 6.5.4 加母液：糖溶解后，按附录 F 吸取母液，即依次加入 A 大量元素 50 mL/L、B 铁盐 10 mL/L、C 微量元素 5 mL/L、D 有机成分 5 mL/L、E 有机成分 10 mL/L；再根据要求加入激素（不耐高温的激素，应在培养基高压灭菌后再过滤灭菌加入）若干，并充分搅拌。 6.5.5 定容：搅拌均匀后，加去离子水至 1 升。 6.5.6 pH 值测定：充分搅拌后，用 pH 计或 pH 试纸测 pH 值，用 0.1 mol/L 的 HCl 或 0.1 mol/L 的 NaOH调节 pH 至要求值，一般为 5.8。 6.5.7 分装：根据不同需要定量分装，如 2

15、50 mL 的培养瓶，每升分装 25 瓶30 瓶，每瓶分装约 33mL40 mL。分装培养基时勿将培养基沾在培养瓶瓶口。 6.5.8 封口：盖好瓶盖，或用封口膜封口，扎绳需紧。 DB33/T 7522009 4 6.5.9 灭菌：分装后应按照 7.1 的要求，在 10 h 内进行高压灭菌。 6.5.10 冷却：灭菌后的培养基应冷却，待完全凝固后再用。 6.5.11 贮存：灭菌后的培养基应注明培养基编号及配制日期。按培养基种类和配制先后分门别类储存于培养基储藏室内。为保证培养基质量，宜将配制好的培养基放置 5 天左右再用，且贮存时间不应超过一个月。 注： 6.5.16.5.11为配制1升 MS培

16、养基的方法，配制其它不同容量MS培养基的方法可参考本方法。 7 消毒灭菌操作 7.1 湿热灭菌 7.1.1 组培中主要采用高压蒸汽灭菌器进行湿热灭菌，高压灭菌器适用于培养基（不耐高温的成分除外）、无菌水、玻璃器皿、金属器械等，以及污染瓶的灭菌处理。 7.1.2 应严格按使用说明书操作各种类型的高压灭菌器。 7.1.3 灭菌要求：一般 1.1 kg/cm21.2 kg/cm2下，121 灭菌 20 min30 min 。 7.1.4 已灭菌的培养瓶或物品不得与未灭菌培养瓶或物品混放；合格的灭菌培养瓶或物品，应注明灭菌日期，合格标志。 7.2 干热灭菌 7.2.1 玻璃器皿及耐热器械应采用干热灭菌

17、。 7.2.2 干热灭菌利用烘箱加热到 160 180 的温度来杀死微生物，通常 170 持续 90 min 进行灭菌。 7.3 过滤灭菌 7.3.1 不耐热的物质需采用过滤灭菌，一些植物激素（如赤霉素、玉米素、脱落酸等）和一些抗生素类通常采用过滤灭菌方法。 7.3.2 过滤灭菌采用滤膜网孔直径为 0.45 m 以下的微孔过滤灭菌器。 7.4 灼烧灭菌 7.4.1 用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌。 7.4.2 灼烧灭菌可采用接种用电热灭菌器或用酒精灯灼烧灭菌。 7.5 擦拭、喷雾灭菌 7.5.1 物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手、植物材料表面等。 7.5.2 擦拭、喷雾灭

18、菌可用 75%的酒精或 0.1%的新洁尔灭菌。 7.6 紫外线灭菌 7.6.1 在接种室、培养室等房间定期用紫外灯灭菌。 7.6.2 紫外灯灭菌一般为 30 min。 7.7 熏蒸灭菌 7.7.1 接种室和培养室定期( 一般 1 年 1 次 2 次) 用高锰酸钾及甲醛混合熏蒸。 7.7.2 熏蒸时，房间关闭紧密，用甲醛（10 mL m）和高锰酸钾（KMnO4， 5 g m）熏蒸 2 d 3 d，通风无味后（一般需 2 d3 d）人员方可进入。 7.8 表面灭菌 组培中的外植体需进行表面灭菌，参见第8 章。 8 培养材料和外植体灭菌 8.1 培养材料的选择 从具有品种典型性状的健康植株上选择芽、

19、茎或、种子、鳞茎、花梗、根等植物材料作为外植体。 8.2 外植体的采集时间 于晴天或露水干后采集外植体。 DB33/T 7522009 5 8.3 外植体灭菌 8.3.1 无菌水的准备：将自来水加入有盖的培养瓶中，按 7.1 的要求进行高压灭菌。 8.3.2 材料预处理：种子预先浸种 0.5 h 至数小时；植物材料除去老叶，剪取所需幼芽茎段（2 cm 3 cm长）、叶片（适当大小）、花梗（约 5 cm 长）、鳞茎、根（约 5 cm 长）等。整理好的外植体，用中性洗衣粉加少许吐温浸泡并振荡 5 min10 min ，自来水冲洗 30 min60 min 。 8.3.3 在超净台上将预处理后的外植

20、体放在有盖容器中，倒入 75%酒精使之没过外植体，并轻摇以除去气泡，经过 10 s50 s ，将酒精倾去，用无菌水冲洗外植体 3 遍。 8.3.4 芽、茎段、叶片及花梗等的灭菌：用 0.5%2.0% 的次氯酸钠溶液浸泡 10 min15 min ，处理过程中要不断轻摇，将外植体表面的气泡除去，灭菌结束后，倒出灭菌液，用无菌水冲洗 3 遍 5 遍后备用。 8.3.5 根、鳞茎等的灭菌：用 1.0%2.0% 的次氯酸钠溶液浸泡 10 min15 min ，处理过程中要不断轻摇，将外植体表面的气泡除去，灭菌结束后，倒出灭菌液，用无菌水冲洗 3 遍 5 遍后备用。 8.3.6 果实和种子的灭菌：果实用

21、 1.0%2.0% 的次氯酸钠溶液浸泡 15 min，无菌水冲洗 2 遍 3 遍后接种果实内的种子或组织；种子用 1.0%2.0% 的次氯酸钠溶液浸泡 20 min30 min ，处理过程中要不断轻摇，将外植体表面的气泡除去，灭菌结束后，倒出灭菌液，用无菌水冲洗 3 遍5 遍后备用。 8.4 升汞的配制和安全使用 8.4.1 使用条件：配备专用的有害液体处理池的单位可使用升汞进行外植体的表面灭菌处理。 8.4.2 升汞溶液的配制浓度和保存：升汞溶液的配制浓度为 0.1%。溶液装在棕色玻璃瓶中贮存。 8.4.3 灭菌时间：0.1% 升汞溶液灭菌 10 min15 min 。 8.4.4 安全管理

22、方法：升汞安全管理方法参见浙江省医疗用毒性药品经营管理办法（试行） 9 接种操作 9.1 操作准备 9.1.1 接种人员应在更衣室更换拖鞋、穿白大褂（或接种服），戴上帽、口罩后进入接种室（或经过风淋室后进入接种室）。 9.1.2 接种人员在接种之前应准备酒精灯或电热灭菌器、酒精或新洁尔灭、无菌脱脂棉或纱布以及接种器械、培养基、接种用苗等。 9.1.3 超净工作台（或洁净无菌接种室）提前 30 min 开机通风，同时打开操作间、更衣间及缓冲间的紫外灯，一般灭杀菌 30 min 后，关掉紫外灯；关紫外线灯 15 min20 min 后人员才可进入室内。 9.1.4 超净工作台消毒：用 75%酒精或

23、 0.1%新洁尔灭仔细擦一遍。 9.1.5 提前 15 min 打开接种用电热灭菌器。 9.1.6 操作人员洗手后，用 75%酒精喷手于操作台内吹干，勿双手互擦。 9.2 提取母瓶 9.2.1 母瓶检查：提取母瓶时要仔细检查母瓶是否污染，若发现污染母瓶应立即剔除。 9.2.2 母瓶预处理：按生产计划提取母瓶，表面喷 75%的酒精后，用无菌纱布擦净，放于操作台旁备用，接种过程中若发现母瓶污染则立即封口。 9.2.3 污染母瓶处理：把污染母瓶放于统一地点供集中处理。 9.3 切割碟子的取放 用无菌镊子从棉布包里取出碟子放在超净工作台面上，应注意手不能接触碟子的边沿。 9.4 接种器械灭菌 9.4.

24、1 接种前接种器械用棉布或纸包好按 7.1 的要求进行高压灭菌。 9.4.2 接种时若使用酒精灯灭菌，从布包里取出接种器械，先用 75%酒精擦拭，再放在酒精灯外焰上灼烤一遍，要求接种器械在火焰上灼烤时间在 10 s 以上。 DB33/T 7522009 6 9.4.3 若使用接种用电热灭菌器，从布包里取出接种器械，先用 75%酒精擦拭，再插入接种用电热灭菌器中进行灭菌，150 250 灭菌 30 s 以上。 9.5 接种 9.5.1 在接种之前，工作人员的手部，包括手腕，都要用 75% 的酒精仔细擦拭一遍。 9.5.2 接种器械按 9.4.2 或 9.4.3 方法灭菌后，在器具搁置架上晾放 2

25、 min 以上备用。 9.5.3 取苗：先打开培养瓶盖，瓶口不要斜向外，取出的苗放于无菌的碟子上分苗；一次取苗不宜太多，以免风干。 9.5.4 切苗：碟子放在离风窗 10 cm20 cm 处；在操作过程中，手术刀和镊子都要在无菌碟子斜上方操作，不应在其正上方操作；切苗过程中产生的废弃物可堆放在无菌的碟子内的一侧，不应散到碟子外。 9.5.5 接苗：打开培养瓶盖，瓶盖朝下放置在无菌的碟子上，碟子应经常用 75% 酒精纱布涂抹灭菌；接苗时，镊子不应碰到培养瓶外壁或瓶口。 9.5.6 一瓶内一般不宜接种得太多，数量因种而异。 250 mL 的培养瓶的一般增殖培养接种数量为 5 株/瓶或 5 团 /瓶

26、，生根培养接种数量为 10 株/ 瓶。 9.5.7 组培苗在瓶内要排放均匀、整齐；接种深度以组培苗不倒为准。 9.5.8 接种器械清洗和灭菌：切割和接种后，接种器械在盛有 75%酒精的瓶中将接种器械上的琼脂和碎叶或碎根漂洗掉；或接种器械用 75%酒精浸湿的纱布擦净；按 9.4.2 或 9.4.3 方法灭菌后晾放备用。 9.6 封口 及时盖上瓶盖，其松紧度以用手转不动为准。 9.7 记录 接种人员将品种代号、培养基类型、个人编号以及接种日期认真标示到瓶上；逐日统计本人的接种数量，包括接种前瓶数和接种后瓶数，字迹工整。 9.8 送苗 接种完毕，把瓶苗送到培养室，宜整齐摆放在指定的组培架上。 9.9

27、 关机 离开之前应熄灭酒精灯或关闭电热灭菌器，把超净工作台收拾干净，清理接种过程中产生的空瓶、垃圾及杂物，擦拭操作台面，并用75 % 酒精喷洒台面，台上的物品也宜摆放整齐；最后关闭超净工作台及电源。 9.10 组培接种人员的注意事项 9.10.1 操作人员应注意个人整洁，勤剪指甲，操作时头、胳膊等不应进入超净工作台内。 9.10.2 操作时不应随意谈话、说笑，以减少污染。 9.10.3 工作人员出入应随手关门。 9.10.4 工作过程中所产生的垃圾应及时清理。 9.11 接种操作的安全管理 镊子、解剖刀、手术剪等接种器械的灭菌采用酒精擦拭或浸泡后在酒精灯上烧烤的方法进行，接种器械烧烤时应远离盛酒精的容器，不应烧烤后立即插入盛酒精的容器中，也应避免碰倒酒精容器或酒精灯后引起失火。在酒精灯点燃后，不可用酒精溶液喷洒超净工作台。万一失火，应立刻关闭电源，用湿布扑灭；若火势较大，用灭火器扑灭。 10 培养室操作 10.1 培养室培养条件调控 培养室的温度一般控制在 25 2，相对湿度70% 80%，光照强度18.75 molm-2s-1 37.5 molm-2s-1（ 1 500 lx 3 000 lx），以每天 12 h16 h 为宜，每天早上、中午、下午各检查一次并做好记录。 10.2 瓶苗摆放