DB43 T 1191-2016 实验鱼类 实验红鲫C1HD系遗传质量控制.pdf

1、湖南省地方标准 DB43 DB43/T 1191 2016 ICS 07.080 B 44 湖南省质量技术监督局 发 布 2017-02-28实施 2016-12-29发布 实验鱼类 Genetic Quality Control of Laboratory Red Crucian Carp C1HD Strain 实验红鲫 C1HD系遗传质量控制 Laboratory FishDB43/T 1191 2016 I 目 次 前言 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 术语和定义 1 4 主要生物学特性 2 5 繁殖方法 5 6 养殖环境 6 7 遗传学质量检测 6 附录 A（资料性附录）

2、实验红鲫人工繁殖方法 8 附录 B（资料性附录） 实验红鲫血清蛋白的聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳方法 10 附录 C（资料性附录） 实验红鲫微卫星（ SSR）分子标记检测方法 12DB43/T 1191 2016 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本文件的某些内容可能涉及专利，本标准起草单位、起草人和 发布机构不承担识别这 些专利的 责任 。 本标准 由湖南省 实验 动物 管理办公室提 出并归口 。 本标准起草单位 ：南华大 学、湖南师 范大 学、 湖南省疾病预防控制中心 。 本标准主要起草人 ：吴端 生、张朝晖 、刘少军 、刘建高。 DB43/T 1191 20

3、16 1 实验鱼类 实验红鲫 C1HD系遗传质量控制 1 范围 本标准规定 了实验红鲫 C1HD系 的名称 、主要生物学特性、养殖环境、繁殖方法、遗传标记和遗传 质量检测方法。 本标准 适用 于实验红鲫 C1HD系 的遗传质量 控制 。 2 规范性引用文件 下列文件 对于 本文件的 应用 是必不 可少 的。 凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的 版本 适用 于本文 件。凡是不注日期 的引用文件， 其最新版 本（ 包括所有的 修改 单） 适用 于本文件。 GB 11607 渔业水 质标准 GB 14923 实验 动物 哺乳类实验 动物的遗传质量 控制 GB/T 18654.1 养殖 鱼类种 质检

4、验 第 1部 分： 检验规则 GB/T 18654.2 养殖 鱼类种 质检验 第 2部 分：抽样 方法 GB/T 18654.3 养殖 鱼类种 质检验 第 3部 分： 性状 测定 GB/T 18654.12 养殖 鱼类种 质检验 第 12部分 ：染色体组型 分析 GB/T 18654.13 养殖 鱼类种 质检验 第 13部分 ：同工 酶 电泳分 析 GB/T 18654.15 养殖 鱼类种 质检验 第 15部分 ： RAPD分 析 NY 5051 无公 害食品 淡水 养殖用 水水 质 3 术语和定义 下列术语和定义 适用 于本标准。 3.1 实验红鲫 （ Laboratory Red Cruc

5、ian Carp） 经人工繁 育， 对其 携带 的病原 微生物及 寄生 虫进行 控制 ，遗传 背景明确或来源 清 楚，用 于 科 学 研究 、 教 学、生 产、检定及 其他科 学实验的红鲫， 称为 实验红鲫。 实验红鲫 C1HD系（Laboratory Red Crucian Carp C1HD Strain ）， 属 于 近交 系 品系。 学名： 红鲫（ Carassius auratus red variety）。 分 类 地 位 ： 硬骨 鱼纲(Osteichthyes) 、 鲤形目(Cypriniformes) 、 鲤科(Cyprinidae) 、 鲤亚科 (Cyprininae)、鲫

6、 属( Carassius)、鲫 (Carassius auratus)。 3.2 近交系 （Inbred Strain ） 在一个 动物 群体中 ， 任 何个 体 基因 组中 99%以上 的等 位位 点为纯合时 定义 为近交系 。 近交 系的 近交 系 数 （Inbreeding coefficient ）应大于 99%。 3.3 基础群 （Foundation Stock） DB43/T 1191 2016 2 指以一个相 对较 少且恒 定的 数 量为基础进行 繁殖生 产的某 动物 种群 ， 即基础种 群， 源于 祖系 ， 具备 该种群 遗传 基础 ，用 于该 种群保持 （种 ）， 并 为

7、 繁殖生 产 提供 种动 物。 3.4 普通环境 （ Conventional Environment） 符合实验 动物生 长繁殖 基本要求 ，且 有基 本病 原控制 措施 的环境。 4 主要生物学特性 4.1 分类形态学特性 4.1.1 外形 体色全 红， 身体 侧扁 ， 全鳞 ， 口端 位， 无须 ，单 尾（ 图 1）。 3 月龄以 下的 个 体体色 为青灰 色， 3月 龄以上 的个 体体色 逐渐转为 红 色。 雄性 个体 鳃盖骨表面具 有追 星， 胸鳍 第 1根硬鳍条 上缘 具有 锯状 齿， 在 繁殖 季节 用手触摸均 有明 显 的粗糙感 。雌 性个 体鳃盖和 胸鳍 则均光滑 。 图 1

8、 实验红鲫 C1HD系 4.1.2 可数性状 背 鳍鳍式为 D. -1619；臀鳍鳍式 为 A. -5 7；胸 鳍鳍式 为 P.-14 17；腹鳍鳍式 为 V. -7 8； 侧线 鳞鳞 式为 。 4.1.3 可量性状 主要可量性 状的 比例值见 表 1。 表 1 实验红鲫 C1HD系主要可量性状的比例值 测量指标 平均值标准差( ) 95%的可信区间 全长/ 体长 1.31 0.12 1.30 1.37 体 长 /体高 2.90 0.39 2.82 3.04 体 长 /头 长 3.39 0.35 3.29 3.41 头 长 /眶间距 2.54 0.32 2.45 2.58 体 长 /尾 柄 长

9、 8.77 1.71 8.37 9.25 尾 柄 长 /尾 柄 高 0.86 0.21 0.80 0.91 体 长 /尾 柄 高 7.18 1.15 6.96 7.60 头 长 /尾 柄 长 2.60 0.59 2.54 2.76 头 长 /尾 柄 高 2.25 0.25 2.15 2.24 体高/ 头高 1.21 0.14 1.18 1.26 DB43/T 1191 2016 3 4.1.4 解剖特征 第 一鳃 弓外 侧鳃 耙数为 42 48个；鳔 为 2 室 ；下 咽齿 2行， 齿式 为 4.4/4.4；脊椎骨 总数为 28枚 ， 肋 骨 13对。 4.2 生长与繁殖特性 4.2.1 生长

10、发育 在 普通 环境 条件 下饲 养， 1年龄 的实验红鲫 C1HD系 平均体 长 约 66 mm，平均 体 重约 12 g； 2 年 龄 的 实验红鲫 C1HD系平均 体长约 113 mm，平均 体重约 34 g。 4.2.2 繁殖生理特性 1年 龄即 达性 成熟 ，属 于一 年多次 产卵 类型 ，性 成熟 的 雌性红鲫， 在生殖 季节里卵巢 系数 达 16% 21%。繁殖方 式为 卵生。 发 育类型 为体 外受精 ，体 外发 育 。 4.3 遗传学特性与标记 4.3.1 染色体数目与核型 体 细胞 染色体数 2n=100（ 图 2A）。 核 型：中部 着丝粒 染色体 （m 组 ） 11对，

11、 亚中部 着丝粒 染色体 （sm 组 ） 15对， 亚端部 着丝粒染色体 （st 组） 12对， 端部 着丝粒 染色体 （t 组） 12对 ，染色体 臂数 （NF） 152（ 图 2B）。 图 2 实验红鲫 C1HD系肾细胞中期染色体分裂相（ A）及核型（ B） 4.3.2 遗传标记 4.3.2.1 体色标记 红体色 为实验红鲫 C1HD系体色基因纯合时 的形 态学标记。 4.3.2.2 生化遗传标记 血清蛋白标记： 血清蛋白聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳 图谱具 有 SP-A1、 SP-B7和 SP-B8特征 带 （图 3）， 此 为 实验红鲫 C1HD系的血清蛋白标记。 DB43/T 1191 2

12、016 4图 3 实验红鲫 C1HD系（H1-H3 ）血清蛋白电泳图谱 注：图 中 A、B 、 C分别 代表 3个区段 ， SP-A1、 SP-B7和 SP-B8为 实验红鲫 C1HD系 特 征 带 同 工 酶 标记 ： 红 细胞酯 酶同 工 酶 （ EST）和 超氧化 物 歧化酶同 工酶 （SOD ）的聚丙烯酰胺凝胶电泳 图 谱 中 ， EST-1、 EST-3酶带 (图 4)和 SOD-3、 SOD-8酶 带 （图 5）分 别 为 实验红鲫 C1HD系特 有的 酯酶同 工 酶标记和 超氧化 物歧化 酶同 工 酶标记。 图 4 实验红鲫 C1HD系（H1-H6 ）EST 同工酶 电泳图谱 图

13、 5 实验红鲫 C1HD系（H1-H6 ）SOD 同工酶 电泳图谱 4.3.2.3 DNA分子 标记 随机扩增多态 性（ RAPD）分子标记 ： 序 列为 “ GACTAAGCCC” 的随 机引物的 PCR扩增产 物中 ， 大 小为 2100 bp的 DNA电泳 条带 ， 为实 验红鲫 C1HD系 RAPD标记（ 图 6）。 DB43/T 1191 2016 5 图 6 实验红鲫 C1HD系（H1-H8 ）RAPD 标记 微卫星（ SSR）标记 ：序 列 为“3 ATTGTGAAGCATCGGTAATGC 和 5TACTTGATTTGCTATTGGAC” 引物的 PCR扩增 产物 中， 大小

14、为 67bp的 DNA电泳 条带 ，为 实验红鲫 C1HD系 SSR标记（ 图 7）。 图 7 实验红鲫 C1HD系 (H1-H8)SSR标记（ 67bp） 5 繁殖 方法 5.1 育种 繁殖 方法 近交系 实验红鲫 育种 采用人工诱导雌核 发育 繁殖 技术（附录 A） 进行 繁殖。 育 种繁殖 过程 中设置 繁 殖记录 卡和繁殖 系谱 。 第一代 红鲫 雌核 发育 二倍 体的繁殖方法 ： 挑选健壮 且符合以上 性状 特征 的 2年龄雌 性红鲫 1尾 ， 采 用人工 诱导雌核 发育 繁殖 技术（附录 A）， 获得 第一代 红鲫 雌核 发育 二倍 体群 体。 第二代 红鲫 雌核 发育 二倍 体的

15、繁殖方法 ： 从 上述 第一 代 红鲫 雌核 发育 二倍 体群 体中 ， 挑选健壮 且符 合以上 性状 特征 的 2年龄 雌性红鲫 1尾 ，采 用人工 诱导雌核 发育 繁殖 技术（附录 A）， 获得 第二 代雌核 发育二倍 体群 体。 实验红鲫 C1HD系基础群 的 构建： 从上 述第 二代 红鲫 雌核发 育二倍 体群 体中 ，选择符合以上 性状 特 征 ， 且体色 全红、 体型 一致 、 健壮 的个 体组 成实验红鲫 C1HD系基础群 ，基础群 大 小不少于 100尾 ，且 具备完整 的遗传 背景 资料（ 包括 品系名称 、近交 代数 及主要生物学特性 等）。 5.2 保种 繁殖 方法 保种

16、繁殖的 原则 是保持 实验红鲫 C1HD系的 同基因 性及 其 基因纯合 性。 作 为保种 繁殖用的 种动 物 必须是基础群中 遗传背景明确，主要生物学特性 符合 本标准的实验红鲫 C1HD系。 从基础群 中， 挑选 符合以上 性 状特 征且 健壮的 2年龄 雌 性实验红鲫 C1HD系 1尾，采 用人工 诱导雌 核发育 繁殖 技术（附录 A） 进行 繁殖，繁殖生 产的子 代 用于构建 实验红鲫 C1HD系 基础群 ，以保持 种源 和传代 。 保种繁殖 过程 中设置 繁殖记录卡 和繁殖 系谱 。 DB43/T 1191 2016 6 5.3 生产 繁殖 方法 从基础群 中挑选 符合以上 性状特

17、征且 健壮 的性 成熟雌 、 雄性实验红鲫 若干 尾， 采 用人工 授精 方法 进 行 随 机交 配繁殖（附录 A），繁殖 代数 不超 过 3代，繁殖生 产的子 代只 供应 实验用。 6 养 殖环境 6.1 水环境 指标 普通环境 条件 下，实验红鲫 饲 养水 质应 符合 GB 11607的要 求， 水环境 指标 应 符合表 2的要 求。 表 2 实验红鲫 水环境 指标 指 标 项 目 单位 水簇箱 水池 水温 18 24 自然水温 日温差 4.0 自然日温差 瞬时温差 3.0 3.0 酸碱度 pH 7.5 8.5 7.5 8.5 溶解氧 mg/L 6 4 硬 度（以 CaCO3计 ） mg

18、L 95 105 95 105 亚 硝酸盐浓度 mg/L 0.4 0.4 水 面 照度 lx 54 324 自然光照 昼夜明暗交替时间 h 14/10 或 12/12 自然昼夜交替时间 6.2 饲养密度 水族箱 饲养实验红鲫， 密度 不 宜大于 表 3的要 求。 表 3 水族箱放养 实验红鲫的规 格与 密度 规格（体长，cm） 密 度（尾/ m 3 ） 水 容 积 为 0.20m 3 水 族箱放养数 量 5 180 36 6 165 33 7 150 30 8 120 24 9 100 20 10 80 15 7 遗传学质量 检测 7.1 抽样方法 和检测频率 抽样方法按 GB/T 18654

19、.2 的规定 执行 。 实验红鲫 C1HD系遗传质量检测频率 ，每 1世 代的每 1繁殖 批次 检测 1次 。 DB43/T 1191 2016 7 7.2 性状 测定 按 GB/T 18654.3 的规定 执行。 7.3 体色分 析 红 色体色 为红鲫 隐性遗传标记， 其控制 基因为 a。 根 据基因 分离 规律 ， 当 体色 基因型 为 aa（ 隐性 纯 合 ） 时， 个 体体色 为红色 ；当体色 基因 型为 Aa（ 杂 合）时 ，则个 体体色 为灰 色。因 此，按照 上述 育 种 繁殖方法 所获得 的实验红鲫子代 ， 如果 体色是 红色 的，则可 初步判 定为纯合 的（ 雌核 发育 二倍

20、 体）实验 红鲫 C1HD系个 体。 7.4 染色体核型 检测 按照 GB/T 18654.12 执行。 7.5 生化遗传标记 检测 血清蛋白标记的检测，按照附录 B执行 。 超氧化 物歧化 酶同 工酶 （SOD）标记的检测，按照 GB/T 18654.13执行 。 酯 酶同 工酶 （EST ）标记的检测，按照 GB/T 18654.13执 行。 7.6 DNA分子 标记 检测 RAPD标记的检测按照 GB/T 18654.15执行 。 SSR标记的检测按照附录 C执行 。 7.7 结果判断 首先对体色 检测 结果 进行 判断 ， 如果 体色是 灰色 或 不全部是 红色，则 判 定 为 不 合

21、 格 ， 对体色 全部 为 红 色 的个 体， 再进行 可数 性 状检测。 当体色 检测 结果 和可 数 性状 检测 结果 均合 格时 ，可 初步判 定为合 格。 可数性 状检测 结果 可疑 或有必要 时，则 进一 步进行 生化遗传标记或 DNA标记的检测。 必要 时进行 染色体 核 型 检测。 对被检 个体 的体色 、可 数性 状 、生 化遗传标记 或 DNA标记 等项 目的检测 结果 均符合 本标准规定的， 则 判 定为合 格。 生化遗传标记或 DNA标记检测结果 的判断 按 GB/T 18654.1 的规定 执行 。 SSR标记检测 结果 的判断 ，按所有样 本平均 期望 纯合 度（ H

22、om）均 在 99%以上判 为合 格。 DB43/T 1191 2016 8附录 A （资料 性附录 ） 实验红鲫 人工 繁殖 方法 A.1 性别鉴别 和亲 鱼选择 在 繁殖 季节 ， 很容 易鉴 别 红鲫雌 雄 。 根 据雄 性红鲫鳃盖表面 和胸 鳍第 1根 硬鳍条均粗糙 ， 轻压 腹部 有乳白 色精 液流 出， 雌性红鲫鳃盖 与胸 鳍光滑 ， 腹 部膨大 ， 肛门 红肿 ， 轻压 腹部有 淡黄 色卵粒 流出 等 特 征 ， 选择 体质 健壮 、无 伤病 、繁殖 力较 强的 2年 龄成熟红鲫 做亲 本。 雌雄 比例 为 1 1。 A.2 人工催产 可选择 使用 鲤鱼 脑垂 体 （PG ）、

23、鱼 用 促 性 腺激素 （LRH-A2）和 绒毛膜促 性腺激素 （HCG） 对 红鲫 进行 催产。 根据 表 A.1于 先天 下午 16:0017:00 时段 注 射催产 。 表 A.1 实验红鲫 人工催产激素 及其剂 量效应 水温（） 催产激素及剂量（每 kg体 重 ） 效 应 时 间 （ h） 18 24 LRH-A2 2 g + HCG 500 IU 9 10 18 24 LRH-A2 2 g + PG 2 mg 10 12 A.3 产卵 与受精 一 般 采用 干法 授精。 即先取 一个 洁净 的搪瓷盘 ， 将 鱼体上 的水 擦干 ，用 手 指 轻压腹 部使 卵子 流入盘 中 ， 接着

24、将雄 鱼的 精液 直接滴在 鱼卵 上， 立即 用羽毛 轻 搅均 匀， 再添加洁净 水， 立 即均 匀地 撒播 在事 先 准备好 的纱网 （鱼 巢） 上进行孵 化。 A.4 孵化 一般采 用静 水孵 化。 即将粘 有 受精卵 的纱网徐徐 放入 水中 ， 置 于水下 2030 cm处 ， 让 其自然 孵化。 为防止 水霉 发生 ，可用 6.0 ppm8.0 ppm的孔 雀石绿浸泡 鱼 巢 15 min 30 min进行 消毒 。 在水 温 18 22 的 条件 下 ，约 孵化 3 d左右 ，鱼苗开始 出膜 ，再 经 24 h全部 孵 化完 毕。 刚孵 出 的 仔 鱼全长 约 为 3 5 mm， 常

25、侧卧 水簇箱 底面 。孵出 2 3 d后 开始摄 食， 这时 可投喂 熟蛋 黄。 A.5 人工雌 核发育 以体色 全红的 2龄 红鲫 作为 母 体， 以 湘江野 鲤或 三角鲂的 精子 作为 激活 源 。用 紫 外线 处理 精子，用 冷休克 进行 卵子 染色体 数目 加 倍。 具体 操作如 下： 在生殖 季节（ 45 月）按 常规方法 以 注射催 产激素 获得红鲫 卵 子和 鲤鱼 或 三角鲂的 精液。 鲤鱼 或 三角鲂 的精 液 用 2倍 体积 的 Hank s液稀释 。 被 稀释 的 鲤鱼 或三角鲂 精液置 于干净 的培 养皿 中 ， 其 厚 度 为 0.10.2 mm， 移 于 2支 15W

26、的 紫外 灯下 ， 灯 管与 精 液面的 垂直 距离 为 12 cm， 开启紫 外灯 照 射 30 min。 照射过程 中， 盛精 液的 培 养 皿 放 在 冰 盘 上 ， 冰 盘 又 放 在 小 摇床上， 不停地缓慢摇 动， 以便精 液在低温 下被 均匀照射。 经 照射的精液 立即置于 4 冰箱中备用， 并 涂片镜检 精子活动能 力。 红鲫卵子 置于干 净的 培养皿中， 立即用经紫外线 照 射 的 鲤 鱼或 三角鲂精 子进行人工授 精， 以 激活 卵子发育。 在精卵相DB43/T 1191 2016 9 遇 后 1 min，开始 进行 冷休 克处理 ，即 将培 养皿 移入 冰箱后 ，用 3

27、min时间 使激活卵 子由 环境 温度 降低 到冷休克 温度（ 04 ）， 再 经 过 冷 休克 （0 4 ）处 理 30 min后， 从冰 箱 中取出， 使其 回升到 环境 温度。 激活 卵或 受精卵均 置于解 剖盘 中静 水孵 化， 每日换 水 24 次。 DB43/T 1191 2016 10 附录 B （资料 性附录 ） 实验红鲫血清蛋白的 聚丙烯酰胺梯度凝胶 电泳 方法 B.1 仪器 与材料 低 温 冰箱 ， 温箱 、离 心机 、PH 计 ，分 析天平 ，制 胶 模具， 浓度梯度 混合 器 ，磁 力 搅拌 机 ，微量 加 样注射 器，电泳 仪，电泳 槽，凝胶 成像 系统 、培 养皿

28、、 EP管等 耗材 。 B.2 试剂 与溶液 B.2.1 试剂 丙烯酰胺（ Arc）， N ,N-亚甲基 双丙烯酰胺 或甲叉双 丙烯酰胺（ Bis）， 三 羟甲 基 氨基 甲烷 (tris)， 乙二胺 四乙 酸二 钠 （ EDTA）， N,N,N ,N-四甲 基乙 二胺 (TEMED)， 过 硫酸 铵， 三 氯醋酸 ， 琼脂糖 ， 溴酚蓝， 考马斯亮蓝 R250，乙醇 ， 肝素 ，氯 化钠 ，蒸馏 水 B.2.2 溶液 1% 琼脂糖 琼脂糖 适量，用电 极缓冲 液配 制。 30%凝胶 液 Arc 57.6g， Bis 2.4g，用 蒸馏 水配 制成 100mL。 4% 凝胶 液 用 30%凝胶

29、液 稀释 7.5倍配 制而 成。 0.3% 过硫 酸铵 过硫 酸 铵 0.3g，用 蒸馏 水配 制成 100mL（仅适 用于 1W）。 凝胶 缓冲 液 tris 21.55g，EDTA 1.85g ，硼 酸 11.0g，用 蒸馏 水配 制成 1000mL， 调至 pH8.4。 再按 100 mL此缓冲 液中 加入 TEMED 0.5mL1.0mL 配 制而成 。 电 极缓冲 液 tris 21.55g， EDTA 1.85g， 硼酸 11.0g，用 蒸馏 水配 制成 1000mL， 调至 pH8.4。 再用蒸馏 水稀释 一倍 。 20% 蔗糖 溶液 蔗糖 2g，用蒸馏 水配 制成 10mL。

30、12.0%三 氯醋 酸 三氯醋 酸 12.0mL，用 蒸馏 水配制 成 100mL。 1.0% 考马斯亮蓝 R250 考马斯亮蓝 R250 1.0g，用乙醇 配制成 100mL。 显 色液 12.0%三 氯醋 酸 100 mL，加入 1.0%考马斯亮蓝 R250 4.0mL。 11 7%醋 酸 醋酸 7.0mL，用蒸馏水 配制 成 100mL。 12 0.85%氯化 钠溶液 氯化 钠 0.85g，用 蒸馏 水配 制成 100mL。 B.3 样品 制备 用一次 性注 射器 从鱼 尾静 脉取血 约 0.5mL， 以 1000rpm 离 心 10min ， 取 上层 血清 置 -10冰 箱保 存 备

31、 用。 B.4 凝胶 制备 使用浓 度梯度 混合 器制备 4%30% 梯度凝胶，用 1%琼脂糖密 封制 胶模 具，凝胶 制成后 在胶 面上 加蒸 馏水封顶 ，20 下聚 合 20min。 其中： A管 液 4% 凝胶 液 10.0mL+凝胶缓冲液 5.0mL+3%过硫酸 铵 5.0mL。 B管液 30%凝胶 液 10.0mL+凝胶 缓冲 液 5.0mL+3%过 硫酸 铵 5.0mL。 DB43/T 1191 2016 11 B.5 电泳 将血清 样品 加入 到等 量的 20%蔗糖 溶液 中， 加微量 溴酚蓝作 为指 示剂 ， 再 混合 ， 然后 用微量 加样 器 将 血清 样品 加入 到凝胶

32、上端 的 样品 槽中 ， 再 小心 加入 电 极缓冲 液盖在 血清 样品上面 ， 注 意勿 将血清 样 品 冲 出 样品 槽。 以 样 品端 为负极 ，连 接电泳 仪 电极 。调至 电压 为 200V，连续 电泳约 15h。 B.6 显色 取出凝胶 片置 于盛满 显色 液的大 培养 皿中 ， 在 37 下用考马斯亮蓝 R250染色 4 h，再 用蒸馏 水漂 洗 2遍， 加入 7%醋酸 ，室温 （ 25） 放置 12 天后用 于 凝胶 成像 系统 扫描 。 DB43/T 1191 2016 12 附录 C （资料 性附录 ） 实验红鲫 微卫星 （SSR ）分子 标记 检测方法 C.1 主要 仪器

33、 高速离 心机 ， 20 冰箱 ， 80 超低 温冰 箱， 紫外 分光光 度计 ， 水 浴箱 ，电子天 平 ，微量 移液 器， 梯度 PCR 仪，pH 计，电泳 仪 ，电泳 槽，凝胶 成像 系统。 C.2 主要 试剂 全血基因组 DNA纯化 系统 ，2Taq PCR SuperMix ， GeneRulerTM 100bp DNA Ladder Plus，pUC19 DNA/Msp（ Hpa） Marker， SDS-PAGE 凝胶 配制 试剂 盒 ，琼脂糖 ，溴 化乙 啶。 C.3 溶液配 制 C.3.1 8%的非变 性聚丙烯酰胺凝胶 分离 胶 30%Acr-Bis(29:1)，4.0mL

34、；1M Tris ， PH8.8，5.7mL ；10% 过硫 酸铵， 0.15mL； TEMED， 0.009 mL； 三蒸 水， 5.0 mL； 配成总 体积 ，15.0 mL 。 浓缩 胶 30%Acr-Bis(29:1)， 0.67mL； 1M Tris， PH6.8， 0.5mL； 10%过 硫酸铵 ， 0.04mL； TEMED， 0.004mL；三 蒸水 ， 2.7mL；配成总 体积 ，4.0mL 。 C.3.2 银染 液 固 定液 ：无 水乙醇 ，250mL；10% 冰醋 酸， 50mL；加三 蒸 水定容 至 500mL。 浸泡 液：无 水乙醇 ，150mL；醋 酸钠 35g，

35、戊二醛 ，0.625mL； 五水合 硫代 硫 酸钠，1mL； 加三蒸 水定容 至 500mL。 染色 液： 硝酸 银， 0.5g；40% 甲醛 ，0.1mL； 加三 蒸水定容至 500mL。 显色 液： 碳酸 钠， 12.5g； 40%甲醛 ，0.05mL 。 终止 液： EDTA-2Na2H 2O，7.3g ；加三 蒸水 定容 至 500mL 。 C.4 样品准备 及其 DNA提取 用 5mL 注射 器从 鱼尾 静脉抽 取 全血， 注入 枸橼 酸钠 抗凝管中 ， 立 即置 于-80 超低温 冰箱 保存 。 基 因组 DNA提 取的 操作步 骤如 下： 取 10L 全血 于 EP管中 ， 加入

36、 30 L 红细胞 裂解液裂 解 10min。 加入 300 L 核裂 解液 ，用移 液器 将其 充分 混匀 。 置 于 55水 浴箱 60min。 静置 至室 温后加入 100 L 饱 和 NaCl， 剧烈振荡 20s。 室 温 13 000rpm离心 2min。 将 上清 液移 入新 EP管中 ， 加入 50 L 饱和 NaCl，剧烈振荡 20s。 室 温 13 000rpm离心 2min。 将 上清 液移 入新 EP管中 ， 加入 300L 异丙 醇，颠倒混 匀 5min，可 见白 色 絮状沉淀 ，即为 析出 的 DNA。 DB43/T 1191 2016 13 室 温 13 000rp

37、m离心 2min。 弃 上清， 加入 500 L 70%乙醇洗 涤。 13 000rpm室温离 心 2min。 弃 上清， 干燥 后加入 100L 无菌去 离子 水。 将提取 的基因组 DNA用紫 外分光光 度计 定量， 紫外 分光光 度仪 预 热 15min， 三 蒸水放 入仪器 中进行 双管调 零， 然后取 1 L DNA用 三蒸 水稀释 一百 倍， 混匀， 加入 检测 杯中 ，分 别测定 260nm、 280nm的吸 光 度 值。 DNA 的 纯度 根据 A260 nm/A280 nm 比值 判定， DNA 纯度 为 1.92.0 方可用 于 PCR扩增 。 DNA样 品保 存于 4 冰

38、箱 备 用。 C.5 PCR扩增 C.5.1 引物 如 表 C.1。 C.5.2 反应 体系 PCR反 应总 体积 为 25 L， 其中 2T aq PCR SuperMix 12.5 L， 上下 游引物各 1 L，无 菌去 离子 水 9 L，模 板 DNA 1.5 L。 C.6 PCR产物 检测 C.6.1 凝胶 制备 C.6.2 电泳 取 10L 的 PCR扩增 产物加 2L 上样 缓冲 液混 匀后 ，在 8%的非变 性聚丙烯酰胺凝胶 上进行 电泳分 离， 电泳缓冲 液为 1 TBE，电压 80V，电泳 时间约 为 3h左右。 C.7 PCR产物 检测 C.7.1 凝胶 制备 C.7.2

39、电泳 取 10L 的 PCR扩增 产物加 2L 上样 缓冲 液混 匀后 ，在 8%的非变 性聚丙烯酰胺凝胶 上进行 电泳分 离， 电泳缓冲 液为 1 TBE，电压 80V，电泳 时间约 为 3h左右。 表 C.1 9对微卫星 引物 序列 及其 PCR反应退火温度 微卫星引物序号 Microsatellites marker number 引物序列 primer sequences 退火温度（） annealing temperature 3CAGAAGCTTCTGGAAATCTGAG 1 5GCGAGAAGATTGATGGACAAC 58.0 3GTCCATTGTGTCAAGATAGAC 2

40、5TCTTCATTTCAGGCTGCAAAG 55.5 3GTCCCTGGTAGTGAGTGAGT 3 5GCGTTGACTTGTTTTATAGTAG 52.0 DB43/T 1191 2016 14 表 C.1 9对微卫星 引物 序列 及其 PCR反应退火温度 （续 ） 微卫星引物序号 Microsatellites marker number 引物序列 primer sequences 退火温度（） annealing temperature 3GCTCCAGATTGCACATTATAG 4 5CTACACACACGCAGAGCCTTTC 52.0 3ATTGTGAAGCATCGGTAAT

41、GC 5 5TACTTGATTTGCTATTGGAC 55.0 3CCCTGAGATAGAAACCACTG 6 5CACCATGCTTGGATGCAAAAG 56.0 3GATCCCTTTTGAATTTTTCTAG 7 5ACAGTGAGGTCCAGAAGTCG 60.5 3GTTGACCAAGAAACCAACATGC 8 5GAAGCTTTGCTCTAATCCACG 55.0 3CACTGACAGTTCACAGGCG 9 5CATTCTCTGCATTTGGGAG 54.0 C.7.3 银染与 显色 使用硝酸 银染色 检测电泳 结果， 染色 方法 如下： 将 凝胶 从电泳 槽中 取下后 ，用

42、三蒸 水漂洗 2次 ，每 次 1 min。 在 固定 液中 固定 20 min， 三蒸 水漂洗 2次 ，每 次 2 min。 在浸泡 液中 浸泡 20 min。 三 蒸水 漂洗 4次 ，每 次 5min。 银染 液中染色 20 min。 三 蒸水 漂洗 3次 ，每 次 5min。 显色 液显 色 5min。 三 蒸水 漂洗 2次 ，每 次 1min。 终止 液中 浸泡 10min。 C.7.4 凝胶成像 系统扫描 使 用凝胶 成像 系统 对显 影后 的凝胶 进行 拍照和分 析。 C.8 数据 分析 按照公 式 C-1、公 式 C-2和公式 C-3，分 别计 算等位 基因 频率 （p ）、 无

43、偏 差 期 望杂 合度（ UHe）和 期望纯合 度（ Hom）。 pi = n 1 f(AA)+ n 2 1 f(AB)（ C-1） 式中： pi 样本 第 i个等位 基因 频率 ； f(AA) 基因 型 为 纯合 子的 个数 ； DB43/T 1191 2016 15 f(AB) 基因 型 为 杂 合 子的 个数 ； n 样本 数量。 UHe = 1 2 2 - n n - 1 2 2 - n n = k i pi 1 2 （ C-2） 式中： Uhe 无偏 差期 望杂 合 度； n 样本 数量 ； k 等位 基 因数 量； pi 样本 第 i个等 位基因 频率 。 Hom =1-UHe （ C-3） 式中： Hom 期望 纯合 度； Uhe 无偏 差期 望杂 合 度。