DB11 T 1053.2-2013 实验用鱼 第2部分 寄生虫学等级及监测.pdf

1、ICS 65.020.30 B 44 备案号 :40367-2014 DB11 北京市地方 标准 DB11/T 1053.2 2013 实验用鱼 第 2部分：寄生虫学等级及监测 Laboratory fish Part 2： Parasitological standards and monitoring 2013 - 12 - 20发布 2014 - 04 - 01实施 北京市质量技术监督局 发布DB11/T 1053.22013 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 寄生虫学等级分类 . 1 5 检测项目 . 1 6 检测程序

2、 . 2 7 检测要求 . 3 8 检测方法 . 4 9 结果判定 . 4 附录 A（规范性附录） 实验用鱼的寄生虫学检测方法 5 附录 B（规范性附录） 寄生虫的染色法和玻片标本制备方法 6 附录 C（规范性附录） 实验用鱼寄生虫的形态、症状和检测方法 8 DB11/T 1053.22013 II 前 言 DB11/T 1053的本部分按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 DB11/T 1053实验用鱼分为六个部分： 第 1部分：微生物学等级及监测； 第 2部分：寄生虫学等级及监测； 第 3部分：遗传质量控制； 第 4部分：病理学诊断规范； 第 5部分：配合饲料技术要求； 第 6

3、部分：环境条件。 本部分为 DB11/T 1053的第 2部分。 本部分 由北京市科 学技术 委员会提 出。 本部分 由北京市科 学技术 委员会归口 。 本部分 由北京市科 学技术 委员会组织 实施 。 本部分起草 单位 ：中国科 学院水 生生物 研究所 、国家人口计 生委科 学技术 研究所。 本部分 主要起草 人： 王桂堂 、 李文 祥、 崔宗斌 、孙德明。 DB11/T 1053.22013 1 实验用鱼 第 2部分：寄生虫学等级及监测 1 范围 DB11/T 1053的本部分规定了 实验用鱼（ 斑马 鱼和 剑尾 鱼）的寄生虫学等级和监测标 准，包括 ：寄 生虫学的等级分类规定、检测要求、

4、检测程序、检测方法、结果判定等要求。 本部分 适用 于实验用鱼（ 斑马鱼和 剑尾 鱼）寄生虫学等级分类和质量监测。 2 规范性引用文件 下列文件 对于 本文件的 应用 是必不可少 的。 凡是注日期的引用文件 ，仅所注日期的 版本 适用 于 本文 件。凡是不注日期 的引用文件，其最新版 本（ 包括所有的 修改单 ）适 用于 本文件。 DB11/T 196 常见 鱼病 防治 技术 操作 规程 3 术语和定义 下列术语和定义 适用 于本文件。 3.1 实验用鱼 laboratory fish 经人工 饲养 、 繁育，对其携带的病 原微生物及寄生虫实行 控制 ， 遗传 背景明确或者来源清楚， 用于 科

5、 学 研究 、教 学、生 产、检定以 及其 他科 学实验的鱼类。 4 寄生虫学等级分类 4.1 普通级实验用鱼 conventional(CV) laboratory fish 不携带所 规定的鱼的 烈性传染病病 原和 与人 共患 病的病原 。 4.2 无特定病原体级实验用鱼 specific pathogen free(SPF) laboratory fish 除 了 普通 级应 排除 的病 原体外，不携带所 规定的 对实验用鱼 危害大 、 重 要潜在感染 或条件 致病和对 科 学实验 干扰大 的病 原体 。 5 检测项目 5.1 外观检查 外观健康 、无异 常。 DB11/T 1053.2

6、2013 2 5.2 寄生虫学检查 寄生虫学等级及检测项目 见表1 。 表1 寄生虫学等级及检测项目 等级 应排除的寄生虫病原体 检测要求 无 特 定 病 原 体 级 普 通 级 原虫 Protozoan 微 孢子虫 Pseudoloma neurophilia 卵圆鞭毛虫 Piscinoodinium pillulare 多子小瓜虫 Ichthyophthirius multifiliis 寄生蠕虫 Helminth 头槽绦虫 Bothriocephalidae 原 虫 Protozoan 斜管虫 Chilodonella 车轮虫 Trichodina 杯体虫 Apiosoma 粘孢子虫 M

7、yxozoan 寄生蠕虫 Helminth 指 环虫 Dactylogyrus 绒毛伪毛细线虫 Pseudocapillaria tomentosa 三代虫 Gyrodactylus 驼 形 线 虫 Camallanidae 寄生性甲壳动物 Crustacean 锚头鳋 Lernaea 注： 必须检测项目：指在进行实验用鱼质量评价时必须检测的项目。 必 要 时 检测项目：指引 进实验用鱼时或怀疑本病流行等必要时要求检测的项目。 6 检测程序 检测程序 见图 1。 DB11/T 1053.22013 3 抽样 编号 外观检 查 麻醉 体外寄生虫学检 查和 取材 剖检及 体内 寄生虫学检 查和 取

8、材 解剖镜 和显 微镜 检查 -必 要 时取 水样 寄生虫学 鉴定 检测结果 检测报告 图 1 检测程序 7 检测要求 7.1 检测频率 常 规性监测： 普通 级和 无特 定病 原体 级实验用鱼 种群每3 个月至 少检 查一 次。 其 他 检测： 需要 时进 行。 7.2 采样要求 7.2.1 采样对象 常 规性监测 ，选择 3月 龄以上 的 成鱼。 7.2.2 采样方式 按照DB11/T 196 执行 。 应 在每一生 产 、实验 设施 内隔离 的 不同 水环境 内随机 抽取样本鱼。病理 样 品 的采集 应与 微生物学、寄生虫学检测 联合 进行 。 7.2.3 采样数量 抽样采集数 量见 表

9、2 。 DB11/T 1053.22013 4 表 2 抽样采集数量 同 一 水 环境实验用鱼数量 抽样数量 100尾 以 下 5 尾 100尾 以 上 5%，最大取样量为30 尾 7.2.4 样本送检及运输 样本送 检运输容器 应清 洁卫 生，防 止 样 本 腐败 或污染。 样本 应有 特定 编号 和标 识并 附送 检单， 写 明 样 本的 来源 、种 、系 、级 别、数 量、检测项目和 采样时间 。 8 检测方法 寄生虫的检测方法按附录 A、B、C 的规定分项 进行 检测。 9 结果判定 9.1 合格判定 每 个 隔离 的水 环境 内所有 样品的微生物学 指标 都符 合该等级标 准要求 ，

10、 则判定该 水 环境 内的实验用 鱼 群 为合 格。 9.2 不合格判定 每个隔离 的水 环境 内如 有一 个 样品 的微生物学 指标 不符合 该等级标 准要求 ， 则判定该 水环境 内的实 验用鱼 群为 不合 格。 A DB11/T 1053.22013 5 附 录 A （规范性附录 ） 实验用鱼 的寄生虫学检测方法 A.1 体外寄生虫 的检测方法 A.1.1 肉眼检查 A.1.1.1 将待检鱼 放在解剖 盘上 ，肉眼检 查鳞 片和 鳍条 上有 无白色 包囊 和寄生虫 存在 。 A.1.1.2 体表检 查之后 ，将鳃盖掀 起，注 意鳃的色 泽， 粘 液的 多 少，有无 白点 ，鳃有 无肿大

11、，鳃丝末 端 是 否肿 大发白 及是 否有 异物存 在等 变化 。 A.1.2 镜 检 A.1.2.1 鳞片和 鳍条： 采用 水浸片法 ， 即用 解剖 刀或 镊子刮 取鳞片和 鳍 条上 的粘 液 ，放 于 载玻片 上 ， 加一滴 清水或 生理 盐水， 用镊子 将组织 分散 ，加上盖 玻片 ，在体 视显 微镜 下观 察 。 A.1.2.2 鳃：先 用剪刀将左右两边 的鳃完整地取 出， 放在培 养皿里 。在每 边鳃 的第一 片鳃片 接近两端 的 位 置用 小剪刀 取一小 块鳃丝， 放在 载玻片 上， 加上 少 量清水， 盖上盖 玻片 ， 在显 微镜 下检 查 。 然 后将 鳃 小 片逐 片剪 开，

12、 在体 视显 微 镜下 用两 根解剖 针， 把鳃丝 逐条分 开， 仔细 检查 ，或 用 镊 子 将 每 片 鳃 片的 鳃上所有 内含 物完 全刮 下， 放 在培 养皿里 ，用 清水 稀释、 搅匀 后， 在解剖镜 下进行 检查 。 A.1.2.3 检查单 殖吸 虫时 ，可 用清水 洗涤 数次 ，倒弃 上清 液后 在解剖镜 下检 查。 A.2 体内寄生虫 的检测方法 A.2.1 根据部 位和 组织 采用 不同 的方法检 查体内 寄生虫。 A.2.2 眼 球 ：采 用 水浸 法， 即将 鱼体的 眼球取 下， 放在盛 有生理 盐水的 培养 皿中， 待寄生虫 游 离出来 后 ， 即可 在体 视显 微镜

13、下观 察 。 A.2.3 体 腔 、脏 器 、生 殖腺 和 鳔： 首 先采 用 肉眼 观察 ， 看组织表 面有没 有肉眼 可见 的白色 包囊和寄生 虫； 然 后将 体腔 用生理 盐水 冲洗 ， 并 盛在 培养 皿中，其 他 组织 用生理 盐水 浸泡 在 培养 皿中， 待 寄生虫游 离 出 来后 ，便 可在体 视显 微镜下 观察 。 A.2.4 肠道： 先用肉眼 检查 ， 看肠 外 壁有 无 白点 ，这些白点 通 常是 微 孢子 虫或 粘孢子 虫的 孢囊。 肠道 内 的寄生虫检测 采用 压片法 ， 先 把肠 外壁 上的 脂肪组织尽 量除干 净， 否 则脂肪 会 混进 肠的 内含 物， 妨碍 观

14、察 。 除 净脂肪 组织 后， 将肠管 前后 拉长 、 剪 开， 如果内 含物 不多 ， 用 解剖 刀将内 含物和 肠壁上的粘液 都刮下来， 用两 片玻片 压成 薄 片， 在解剖镜 下直 接检 查 寄生 蠕虫； 如果 肠内 含物较 多， 则应 将 肠 的 内 含 物先取 下来， 放在 培养 皿里 ， 用生理 盐水 冲洗搅匀 ，在显 微镜 下检 查寄生虫。 A.3 其它检测方法 寄生虫的检测 除了 活体 检测 ， 还可 以通 过寄生虫标本的简 单染色法（附录 B）和 常 规的 组织 切片法 来对寄生虫 进行 形态 鉴定。 DB11/T 1053.22013 6 附 录 B （规范性附录 ） 寄生

15、虫 的染色 法和 玻片 标本 制 备方法 B.1 原虫的涂片染色 法 B.1.1 把保存 在70 酒精 里的 原虫 涂 片放 到梯度酒精 水化 ，每一 阶段 5min6min。 B.1.2 然 后 把涂 片放 进2 的 铁明矾溶液 中媒 染， 纤毛 虫2h 4h， 鞭毛 虫和 粘孢子 虫6h 10h。 B.1.3 媒 染 后， 用蒸馏 水洗 2次 ， 每次4 min 5 min， 然后放 进 海氏苏木精溶 液中 染色。 B.1.4 染色的 时间 ：纤 毛虫 2h 4h， 鞭毛 虫和 粘孢子 虫6h 10h。 B.1.5 染 好 后取 出， 用蒸馏 水冲洗粘 附 在玻片 上的染料 ， 放 入 2

16、的 磷钨酸溶 液中 褪色。 在 褪 色过 程中， 每隔一 定时 间要 放在显 微镜 下 观察 ，当核 成紫蓝 色， 细 胞质为 浅灰蓝 色， 纤毛 和 鞭毛 都看得 见， 即 可， 褪 色 时间 大约 6h8h 。 这 时把涂 片从 染色 缸中 取出 ， 涂面 朝上 ， 放 在盛 有自 来水的 培养 皿中， 用微流水 冲洗0.5h ， 然后 用梯度酒精 脱 水， 每一 阶段 5 min， 但在95 和无 水酒精 中的时 间 为 10 min，然 后移至 二甲苯 ，透 明10 min 。 B.1.6 最 后 把已透 明的 涂片 放在 滴有加 拿大 树胶 的清 洁载 玻片上 ，封固 ，贴 上标 签

17、。 B.2 吸虫、绦 虫、棘头 虫的整 体染色 法 B.2.1 把保存 在70酒精 里的标本（挑 选压得 平整 、姿态 正常的） 放 到梯度酒精水 化，每一 阶段 10mi n 15 min，然 后用 爱氏苏木精染色。 B.2.2 把蒸馏 水洗过 的虫 体放进 染色液 中，经 1h3h （视 虫体大小 而 定） 后，水洗 ；如染色 太深 ，可 放 在 1酸酒精 （ 1%盐酸 乙醇 液 ：盐 酸 1份 +70%乙醇100 份 ） 中褪 色。 在褪 色 过程中，要 时常 在体视 显微 镜下观 察， 当虫 体体 壁呈现 为 浅灰蓝 色， 内部 器官 为紫蓝 色时 就可 以中 止褪 色处理。 B.2.

18、3 褪 色 好的标本用微 流水 冲洗 至 少1h （ 或多 次换 水） ， 然后用 梯度酒精 脱水， 每一阶段停留 10min 15 min。 在95 和无 水酒精 两 阶段 ，都 必 须更换 一 次酒精 ，时 间也要 延长 一 些。再 从1/2 无水酒精 1/ 2二 甲 苯接 着移 至 纯二 甲苯中，时 间相同 ，使 虫体透 明，然 后用镊 子或 干燥吸 管取虫 体，放 在滴 有加 拿 大树胶 的载 玻片 上， 用针 将虫体 拨正 ，盖上盖 玻片。 B.3 几种不 需要 染色的 寄生虫 处理方法 B.3.1 具有几丁 质的甲壳 类、单殖吸虫和 棘头 虫 把 固 定的标本 取出 ， 放 在载玻

19、片上 ， 用 吸水 纸把 虫体 上 表面的 水分 吸干 ， 然 后滴上适 量的配 好的 4 聚乙烯醇 于虫 体上 ，在体 视显微 镜下 用竹签 把虫 体拨正， 盖上盖 玻片 即可 。 B.3.2 线 虫 把 用 巴氏 液 固定的 线虫取 出，放 在20 甘油 酒精中， 然 后逐 步 上升 至 40 、60 、 80和100 甘 油，每一 阶段 6h12h ，待虫 体 透明 后可 取出 在显 微镜 下 观察 。标本 应固 定在 甘油胶胨 中。 B.3.3 粘孢子 虫 B.3.3.1 悬滴法 :把 新鲜 的粘孢子 虫的 包 囊放 在干 净的 盖玻片 上， 加一 滴水， 把 包囊 弄破， 在上 面盖

20、 一 小 块 的盖 玻片 ， 用 吸水 纸吸出 多 余的 水分。 然后 使带有小 盖 玻片的 一面 朝下， 放在一 张凹 玻片的 凹洞 里， 这 样 可以在 油镜 下观 察。 B.3.3.2 甘油胶胨 法: 把包 囊放 在载玻片的 中间 位置 ， 弄破 包 囊， 用小 镊子取一小 块甘油胶胨 ， 放在孢 子 的 位置上 面， 把载 玻片 放在酒精 灯的 火焰 上略 为加 热 ， 等 甘油胶胨 完全 融解 ， 盖上盖 玻片 ， 轻轻压平， 平 放 在桌 上。 DB11/T 1053.22013 7 B.3.4 纤毛虫 甘油酒精 法 ，把 已固 定 在5 福尔 马林中 的纤 毛虫取 出，保 存在1

21、0 的 甘油酒精 中， 观察时取 出标 本 放 在载 玻片 上， 盖上盖 玻片， 从一 旁加 入10 的 甘油酒精 ， 让 酒精逐 步挥 发， 甘油 逐步 变浓 ，经 24h， 虫 体 变成 透明 。 DB11/T 1053.22013 8 附 录 C （规范性附录 ） 实验用鱼寄生虫 的形态、症状和检测方法 表 C.1 实验用鱼寄生虫 的形态、症状、 检测方法 寄生虫名称 寄生虫形态特征 临床症状 检测 方法 微孢子虫 Pseudoloma neurophilia 胞 内 寄生， 孢子为卵形或梨形， 后端有一突出的液 泡。孢子大小 5.4 m 2.7 m。 感 染 中 枢神经系统 （脑和脊髓

22、）。病鱼 身体消瘦，脊椎骨弯曲。 组织 切片 法 卵圆鞭毛虫 Piscinoodinium pillulare 营 养 体卵圆形，不 透 明，不 能 运 动 。大小约为(912) m (4090) m。 寄生于皮肤 和鳃。病鱼通常 悬 浮在水 体的表层，呼吸困难。又名丝绒病。 水 浸 片法 多子小瓜虫 Ichthyophthirius multifiliis 成虫卵圆形， 乳白色。 体有分布均匀的可运动的纤 毛， 胞口位于体前端腹面， 体中 部有一马蹄形大核。 成虫大小为(0.30.8) mm (0.350.5) mm。 寄生于皮肤 和鳃。 严重感染的病鱼乏 力，粘液增 多，呼 吸困难， 体表

23、 呈现 许多小白点，又名白点病。 水 浸 片法 斜管虫 Chilodonella 腹面呈卵形， 左右各具纤毛带。 胞口在前端， 具漏 斗状口管， 末端紧缩， 向左作螺旋状绕一圈。 后端 大、小核各一个。大小(4060) m (2547) m。 寄生于体表 和鳃。病鱼粘液 增 多，体 表形成苍白 色或淡 蓝色粘液 层 ，组织 破坏，呼吸困难。 水 浸 片法 车轮虫 Trichodina 虫 体圆形， 大小 20 m40 m构 成 齿 环的齿体具有 发达的空锥形部以及向外的齿钩和向中心的齿棘。 寄生于鳃和 皮肤。病鱼产生 大 量的粘 液，鱼体消 瘦，发 黑，游动 缓慢 ， 呼 吸 困难。 水 浸

24、片法 杯体虫 Apiosoma 虫 体 呈 杯 状 ， 前 端 粗 ， 后端变窄。前 端 有 1圆 盘 形 的 口 围 盘 ， 四周有纤毛。虫 体大小为(1480) m (1125) m。 寄生于鳃和 皮肤。病鱼游动 缓慢 ， 呼 吸 困难。 水 浸 片法 粘孢子虫 myxozoans 孢 囊白色，孢子有极囊。 寄生于肾、 胆囊、 输尿管、 肠 、鳃、 体表等处。病鱼消瘦，体色发黑。 水 浸 片法 指环虫 Dactylogyrus 后 吸 器 具 7对 边 缘 小 钩 ， 1对中 央大钩， 眼点 2对。 虫体大小为(0.21.4) mm (0.070.35) mm。 寄生于鳃。病鱼鳃丝 粘 液

25、 增多， 呼 吸 苦难，游动缓慢。 水 浸 片法 三代虫 Gyrodactylus 后 吸 器 具 1对中央大钩， 16个 边 缘 小 钩 ， 无 眼点。 虫体大小为(0.30.6) mm (0.070.15) mm。 寄生于体表 及鳃。病鱼粘液 增 多，鱼 体消瘦，呼吸困难。 水 浸 片法 绒毛伪毛细线虫 Pseudocapillaria tomentosa 雌 虫 7 mm 12 mm， 卵 椭 圆 形 ， 两 头 有 塞 子样的 结构； 雄虫 4 mm 7 mm， 后 部 有 一粘液囊和平滑 的交合刺。 寄生于内脏 ，严重感 染的病鱼体 色 发 黑 ， 瘦弱，游动无力。 压 片 法 头槽

26、绦虫 Bothriocephalidae 头 节 有 一 个 明 显 的 顶 端盘和两个较深的吸沟， 成熟 接片都有一套生殖系统。 钩球蚴阶段在中间宿主剑 水鳋或水蚯蚓内发育成原尾蚴。 寄生于肠道 ，影响 生长发育，体 色 发 黑 ， 消 瘦 。虫 体大量繁殖后阻塞 肠道， 可形成穿孔。 压 片 法 驼形线虫 Camallanidae 虫 体细长，尾部很尖细，活体为红色，肉眼可见。 口囊由几丁质侧瓣组成， 侧瓣有纵肋纹， 旁有三角 形几丁质突起，生殖孔位于体中部。 寄生于肠道 ，严重感 染病鱼 消 瘦，肠 壁发炎。 压 片 法 DB11/T 1053.22013 9 表 C.1 实验用鱼寄生虫 的形态、症状、 检测方法 (续) 寄生虫名称 寄生虫形态特征 临床症状 检测 方法 锚头鳋 Lernaea 头 胸 部分枝， 具有 1对角或 2对角。 颈部细长呈圆 柱状， 渐渐扩大为躯干部， 腹 部短， 钝圆， 在末端 有 1对小而分节的尾叉。 寄生于体表 。病鱼 食欲减退 ， 身体消 瘦，行动迟 缓，使 小鱼失去 平 衡，产 生畸形弯曲。 肉眼 观 察 水 浸 片法 _