第七章 蛋白质与氨基酸的测定.ppt

1、第七章 蛋白质与氨基酸的测定,第一节概述 第二节各种食品中蛋白质含量及测定意义 第三节蛋白质换算系数 第四节蛋白质的测定方法,食品分析,第一节 概 述,pro是食品的重要组成之一，也是重要的营养物质，一个食品的营养高低，主要看蛋白质的高低。pro除了保证食品的营养价值外，在决定食品的色、香、味及结构等特征上也起着重要的作用。,第七章 蛋白质与氨基酸的测定,一、pro组成与分类,1、组成pro是复杂的含氮有机化合物，它的溶液是典型的胶体分散体系，由两性氨基酸通过肽键结合在一起的大分子化合物，它主要含的元素是C 、H、O、N、S、P另外还有一些微量元素Fe、Zn、I、Cu、Mn。对于不同的pro，

2、它的组成和结构不同，但从分析数据可以得到近似的pro的元素组成百分比。,第一节 概 述,一般来说，pro的平均含氮量为100/160，所以在用凯氏定氮法定量pro时，将测得的总氮%乘上pro的换称参数K=6.25即为该物质的pro含量。注意：当测定的样品其含氮的系数与上面100/16相差较大时，采用6.25将会引起显著的偏差。,第一节 概 述,一、pro组成与分类,2 氨基酸的组成上面我们已讲了pro是由氨基酸组成的高分子化合物，目前各种氨基酸已达175种以上，但是构成pro的氨基酸主要是其中的20种，氨基酸是由脂肪酸碳链上的氢原子（NH2）所置换而得到的。,第一节 概 述,一、pro组成与分

3、类,二 pro变性pro 受热或其它处理时，它的物理和化学性质会发生变化，这个过程称为变性作用，pro发生变性作用后，pro的许多性质发生了变化，溶解度降低，发生凝结，形成不可逆凝胶，-SH暴露在外面，引起pro变性的因素主要是热、酸和碱，化学试剂、重金属盐等。,第一节 概 述,第二节 各种食品中蛋白质 的含量及测定意义,一.含量由于食品种类很多，所以pro含量分布是不均匀的，一般动物组织pro含量高于植物组织，而且动物组织以肌肉内脏含量较多于其他部分，植物是以种子含量高，豆类含pro最高，如黄豆pro含量在40%。,第七章 蛋白质与氨基酸的测定,二.测定意义,1. pro是组成人体的重要成分

4、之一，人体的一切细胞都由pro组成2 .pro维持体内酸碱平衡3 .pro 是食品的重要组织部分之一，也是重要的营养物质4 .pro 是评价食品质量高低的指标，还关系到人体健康。,第二节 各种食品中蛋白质的含量及测定意义,第三节 关于氮-pro换算等数,对于氮含量换算成pro含量的等数，历来采用6.25，这个数值是以pro平均含氮而导出的数值，但是食品中含氮的比例，因食品种类不同，差别是很大的，我们在测定pro时，应该是不同的食品采用不同的换算等数，一般手册上列出了一部分换称等数，用时可查，,第七章 蛋白质与氨基酸的测定,蛋=6.25，肉=6.25，牛乳=6.38，稻米=5.95，大麦=5.8

5、3，玉米=6.25，小麦=5.83，麸皮=6.31，面粉=5.70，如果手册上查不到的样品则可用6.25，一般在写报告时要注明采用的换算等数以何物代替。,第三节 关于氮-pro换算等数,第四节 蛋白质的测定方法,pro的测定方法分为两大类：一类是利用pro的共性，即含氮量，肽链和折射率测定pro含量，另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸、碱性基团和芳香基团测定pro含量。但是食品种类很多，食品中pro含量又不同，特别是其他成分，如碳水化合物，脂肪和维生素的干扰成分很多，因此pro的测定通常利用经典的剀氏定氮法是由样品消化成铵盐蒸馏，用标准酸液吸收，用标准酸或碱液滴定，由样品中含氮量计算出pr

6、o的含量。由于食品中pro含量不同又分为凯氏定氮常量法、半微量法和微量法，但它们的基本原理都是一样的。,第七章 蛋白质与氨基酸的测定,一、 凯氏定氮法这种方法是1883年Kjeldahl发明，当时凯氏只使用H2SO4来分解试样，来定量谷物中的pro，他只知用H2SO4分解试样，而不能阐明H2SO4分解有机氮化合物生成氨的反应历程，所以只使用H2SO4分解试样，需要较长时间，后来由Gunning加入改进，他改进的办法是在消化时加入K2SO4使沸点上升，这样加快分解速度，因为温度由原来硫酸沸点的380上升到400，提高了不到67所以速度也就加快了，凯氏定氮法至今仍在使用。,第四节 蛋白质的测定方法

7、,我们在检验食品中pro时，往往只限于测定总氮量，然后乘以pro核算等数，得到蛋白质含量，实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、叶啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物，故称为粗pro。,第四节 蛋白质的测定方法,一、 凯氏定氮法,凯氏定氮法试验仪器图,1、 凯氏常量定氮法：,不论常量、半微量以及微量定氮法它们的原理都是一样的，首先第一个步骤是消化： （1）消化：样品与硫酸一起加热消化，硫酸使有机物脱水。并破坏有机物，使有机物中的C、H氧化为CO2和H2O蒸汽逸出，而pro则分解氮，则与硫酸结合成硫酸铵，留在酸性溶液中。,第四节 蛋白质的测定方法,一、 凯氏定氮法,在消化过程中添加硫酸钾可以提高温度加快有

8、机物分解，它与硫酸反应生成硫酸氢钾，可提高反应温度，一般纯硫酸加热沸点330，而添加硫酸钾后，温度可达400，加速了整个反应过程。此外，也可以加入硫酸钠，氢化钾盐类来提高沸点。其理由随着消化过程硫酸的不断地被分解，水分的逸出而使硫酸钾的浓度增大，沸点增加。加速了有机的分解。但硫酸钾加入量不能太大，否则温度太高，生成的硫酸氢铵也会分解，放出氨而造成损失。,第四节 蛋白质的测定方法,一、 凯氏定氮法,1、 凯氏常量定氮法：,（1）消化：,为了加速反应过程，还加入硫酸铜，氧化汞或硒粉作为催化剂以及加入少量过氧化氢，次氯酸钾作为氧化剂。但为了防止污染通常使用硫酸铜。所以有机物全部消化后，出现硫酸铜的兰

9、绿色，它具有催化功能，还可以作为碱性反应指示剂。,第四节 蛋白质的测定方法,一、 凯氏定氮法,1、 凯氏常量定氮法：,（1）消化：,（2）蒸馏：样液中的硫酸铵在碱性条件下释放出氨，在这操作中，一是加入氢氧化钠溶液要过量，二是要防止样液中氨气逸出。,第四节 蛋白质的测定方法,一、 凯氏定氮法,1、 凯氏常量定氮法：,（3）吸收与滴定：蒸馏过程中放出的氨可用一定量的标准硫酸或标准盐酸溶液进行氨的吸收，然后再用标准氢氧化钠溶液反滴定过剩的硫酸或盐酸溶液，从而计算出总氮量。半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收后，再用标准盐酸直接滴定，硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影响指示剂变色反应，它有吸收氨的作用。,第四

10、节 蛋白质的测定方法,一、 凯氏定氮法,1、 凯氏常量定氮法：,操作步骤,准确称取样品中0.50-2.00g于500ml凯氏瓶中加10g无水K2SO4加0.5gCuSO4加20ml H2SO4在通风橱中先以小火加热，待泡沫消失后，加大火力，消化至透明无黑粒后，将瓶子摇动一下使瓶壁炭粒溶于硫酸中继续消化30分钟至到样液呈绿色状态，停止消化，冷却加200ml水连接蒸馏装置用硼酸作吸收液在K氏瓶中加波动珠数粒和80ml50% NaOH立即接好定氮球加热至到K氏瓶内残液减少到三分之一时，取出用水冲洗用0.1N HCl滴定。,第四节 蛋白质的测定方法,一、 凯氏定氮法,1、 凯氏常量定氮法：,计算：总氮

11、量%= - 1000.014-氮的毫克当量数 pro%=总氮%K 乳制品K=6.38（N=15.7%） 小麦粉K=5.79（N=17.6%） 动物胶K=5.6（N=18.0%） 冰蛋K=6.7（N=14.8%） 大豆制品K=6.0（16.7%） K=6.25则（N=16%） K-换称等数,第四节 蛋白质的测定方法,一、 凯氏定氮法,1、 凯氏常量定氮法：,N（V2-V1）0.014,W,各种试剂的作用,（1）浓H2SO4：A：脱水使有机物炭化，然后有机物炭化生成碳，碳将H2SO4还原为SO2，本身则变为CO2B： 氧化C： pro与浓H2SO4生成NH3，CO2，SO2，H2OD： NH3与H

12、2SO4生成硫酸铵,第四节 蛋白质的测定方法,一、 凯氏定氮法,（2）CuSO4的作用（催化剂）CuSO4为红色沉淀，当C完全消化后，反应停止，红色消失，变为兰色，即为消化达到完全，兰色为CuSO4的颜色（3）K2SO4的作用（提高沸点）沸点由330提高到400加速了反应过程。（4）硒粉和过氧化氢，氧化汞都为催化剂，但为了防止污染通常采用硫酸铜(5)50%NaOH的作用,第四节 蛋白质的测定方法,一、 凯氏定氮法,各种试剂的作用,下面我就针对几点来说明为何影响氨化完全和速度快的因素 （1）K氏烧瓶和取样量如果称1g以上的样品，就需要K氏烧瓶最小500ml，8001000ml的更好，这样的K氏烧

13、瓶对于缩短氨化时间，加热的均匀性和完全氨化效果最好。,第四节 蛋白质的测定方法,一、 凯氏定氮法,（2）分解剂 H2SO4和K2SO4的添加量有机无分解需要H2SO4量，H2SO4应根据有机物种类不同而加的量就不同，如果试样含脂类高，则加H2SO4多，为了提高分解温度，要大量添加K2SO4，但不能太多，也不能太少，太少则氨化不充分。K2SO4和H2SO4的添加比例是：1g样品 K2SO4： H2SO4=7g：12ml这种比例在国内外都使用，是公认的还有一种比例： K2SO4：H2SO4=10：20ml,第四节 蛋白质的测定方法,一、 凯氏定氮法, 催化剂用作催化剂的有Hg、HgO、Se，硒化合

14、物，CuSO4、TiO2，对Hg，HgO有毒但结果好，Se与CuSO4得到结果是一种，TiO2，的结果偏低，采用不同的催化剂则消化时间不同， HgO消化麦子为38，Se与CuSO4消化麦子55，TiO2消化麦子70，所以在给出测定结果时要注明催化剂的类型。,第四节 蛋白质的测定方法,一、 凯氏定氮法,（2）分解剂,（3）热源的强度消化时热源的强度同迅速消化和完全氨化关系很大，即便盐类K2SO4加得多，如果热源弱，也是没有意义的，热源过强导致H2SO4损失，使氨回收率低，另外K氏瓶的容量大小，颈部的粗细和长短等，也与热源的强度有关。,第四节 蛋白质的测定方法,一、 凯氏定氮法,(4）氨的蒸馏和吸

15、收及滴定蒸馏有两种: 1 直接蒸馏（装置简便，准确性好）2 水蒸汽蒸馏蒸馏加NaOH是50%，加的量为H2SO4量的4倍，硫酸量为12ml，则NaOH为124=48ml，而且一般高于这个理论值，即加到5055ml，如果NaOH量加的不够就变成H2S， H2S是强酸，使颜色变红。,第四节 蛋白质的测定方法,一、 凯氏定氮法,吸收液有：1、标准H2SO4 用标准碱返滴定，甲醛红指示剂 2 、硼酸 用HCl进行滴定，混合指示剂目前都用硼酸吸收液，用硼酸代替H2SO4，这样可省略了反滴定，H2SO4是强酸，要求较严，而硼酸是弱酸，在滴定时，不影响指示剂变色范围，另外硼酸为吸收液浓度在3%以上可将氨完全

16、吸收，为保险期间一般用4%。,第四节 蛋白质的测定方法,一、 凯氏定氮法,(4）氨的蒸馏和吸收及滴定,实验注意事项,a.样品应时均匀的，若是固体样品应事先研细，液体样要混合均匀。 b.样品放入K氏烧瓶时，不要黏附瓶颈上，万一黏附可用少量水缓慢冲下，以免被检样消化不完全，使结果偏低。 c.消化时，如不容易呈透明溶液，可将K氏烧瓶放冷后，加入30%过氧化氢催化剂23ml，促使氧化。,第四节 蛋白质的测定方法,一、 凯氏定氮法,d.在整个消化过程中，不要用强火，保持和缓的沸腾，使火力集中在K氏烧瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失。 e.如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失

17、，这时会形成硫酸氢钾，而不与氨作用，因此当硫酸过多底物被消耗掉或样品中脂肪含量过高时，要添加硫酸量。 f.混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色，如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲醛红乙醇溶液。,第四节 蛋白质的测定方法,一、 凯氏定氮法,g.氨是否完全蒸馏出来，PH试纸检查馏出液是否为碱性。 h.向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀无。这时由于分解促进剂与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀，有时Cu离子与氨作用生成深兰色的络合物。 i.消化剂绿色后继续消化30分钟即可。,第四节 蛋白质的测定方法,一、 凯氏定氮法,2、K氏微量定

18、氮仪法 3、K氏半微量定氮仪法(2、3原理一样)操作方法大同小异，半微量法消化后，定容100ml，然后吸25ml蒸馏吸收液吸收。 N（V2-V1）0.014 W N（V2-V1）0.014 计算总氮%= -100 - W,第四节 蛋白质的测定方法,一、 凯氏定氮法,4、K氏自动定氮法,原理与上面一样，仪器，采用K氏自动定氮仪：其装置内具有自动加碱蒸馏装置，自动吸收和滴定装置以及自动数字显示装置，消化装置：由优质玻璃制成的K氏消化瓶以及红外线装置的消化炉。,第四节 蛋白质的测定方法,一、 凯氏定氮法,氨基酸总量测定,pro经水解或酶解可由大分子变成小的pro成分，如水解后的产物经胨，肽等最后成为

19、氨基酸，氨基酸是构成pro最基本的物质。水解后的pro和水解前的pro在物理特性，化学结构以及被吸收消化的程度上是很不相同的，其差别与水解的程度有密切关系，分析氨基酸的含量就可以知道水解的程度，也就可以评价食品的营养价值。,第四节 蛋白质的测定方法,氨基酸不是单纯的一种物质，用氨基酸分析仪可直接测定出17种氨基酸（仪器价格昂贵，不能普遍使用），对于食品来说有时有很多种氨基酸可以同时存在于一种食品中，所以需要测定总的氨基酸量，它们不能以氨基酸百分率来表示，只能以氨基酸中所含的氮（氨基酸态氮）的百分率表示，当然，如果食品中只含有一种氨基酸，如味精中的谷氨酸，就可以从含氮量计算出氨基酸的含量。,第四

20、节 蛋白质的测定方法,氨基酸总量测定,食品在评价蛋白质的营养价值时，除了测定pro的含量，氨基酸氮含量，还需要对各种氨基酸进行分离，鉴定，尤其对8种人体必需氨基酸进行定量定性分析。,第四节 蛋白质的测定方法,氨基酸总量测定,单指示剂甲醛滴定法：,1、原理：氨基酸具有酸，碱两重性质，因为氨基酸含有-COOH基，而-COOH基显示酸性，又含有-NH2，-NH2则显示碱性，由于-COOH基和-NH2的相互作用，使氨基酸成为中性的内盐，当加入甲醛溶液时，-NH2与甲醛结合，其碱性消失，破坏内盐的存在，就可用碱来滴定-COOH基，以间接方法测定氨基酸的量，反应式以三种形式存在。用碱完全中和-COOH基时

21、的PH值为8.49.2。,第四节 蛋白质的测定方法,2、试剂：,（1）40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，将甲醛用1N NaOH溶液中和（淡兰色）。（2）0.1%百里酚酞乙醇溶液。（3）0.100N NaOH标准溶液。,第四节 蛋白质的测定方法,单指示剂甲醛滴定法：,3、操作步骤：,称约含20mg左右的氨基酸于烧杯中（如为固体样加水50ml）加两滴指示剂用0.1N NaOH溶液滴定到淡兰色加中性甲醛20ml摇匀静置1分钟此时兰色应消失再用0.1N NaOH溶液滴定淡兰色，记录两次滴定所消耗的碱液毫升数。计算：氨基酸态氮=（NV0.014100） /W100,第四节 蛋白质的测定方法,单指示

22、剂甲醛滴定法：,双指示剂甲醛滴定法,1原理氨基酸具有酸性的COOH基和碱性的NH2基。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当假如甲醛溶液时，NH2基于甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用强碱标准溶液来滴定COOH，并用间接的方法测定氨基酸总量。 2试剂,第四节 蛋白质的测定方法,3操作方法移取含氨基酸约20-30mg的样品溶液2份，分别置于250mL锥形瓶中，各加50mL蒸馏水，其中1份加入3滴中性红指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至由红变为琥珀色为终点；另1份加入3滴百里酚酞指示剂及中性甲醛20mL，摇匀，静置1分钟，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色为终点。

23、分别记录两次所消耗的碱液mL数。,第四节 蛋白质的测定方法,双指示剂甲醛滴定法,4计算 氨基酸态氮（%）= C为氢氧化钠标准溶液的浓度（mol/L）; V2为用中性红指示剂滴定时消耗的氢氧化钠标准溶液体积（ml）; V1为用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积（ml）; m为测定用样品溶液相当于样品的质量（g）; 0.014为氮的摩尔质量（g/mol）,第四节 蛋白质的测定方法,双指示剂甲醛滴定法,5说明及注意事项 （1）此法适用于测定食品中的游离氨基酸。 （2）若样品颜色较深，可加适量活性炭脱色后再测定。,第四节 蛋白质的测定方法,双指示剂甲醛滴定法,思考题：1 、试述蛋白质测定中，样品消化过程所必须注意的事项，消化过程中内容物颜色发生什么变化？为什么？2 、样品经消化进行蒸馏前，为什么要加入氢氧化钠？这时溶液发生什么变化？为什么？如果没有变化，说明什么问题？须采用什么措施？3 、 硫酸铜及硫酸钾在测定中起了什么作用？ 4 、试述氨基酸态氮的测定原理。5 、结果计算中为什么要乘上蛋白质系数？,第七章 蛋白质与氨基酸的测定,