1、第一节 PCR扩增获得目的基因或cDNA 第二节 基因组文库的构建与基因分离 第三节 cDNA文库的构建与筛选 第四节 根据差异表达获得目的基因 第五节 基因的化学合成,第五章 目的基因的获得,基因克隆的本质是把某一目的DNA片段通过无性方式进行扩增和表达，而这一过程往往是通过载体和寄主细胞来实现的。一般而言，基因克隆包括四部分工作： 1、目标DNA片段的获得； 2、克隆载体的构建； 3、寄主细胞的转化； 4、重组体克隆的选择和鉴定。目前，以大肠杆菌为寄主，以质粒和噬菌体等为载体的基因克隆体系已经相当的成熟。,大肠杆菌作为寄主进行DNA克隆的实验方案,DNA片段 的获得,载体构建,细菌转化,重
2、组体 的鉴定,限制性内 切酶消化,机械切割,双链cDNA 的合成,化学法 直接合成,同聚物 加尾,粘性末端 连接,平末端 连接,加接头造成 粘性末端,重组噬菌体 DNA转染,重组质粒 的转化,体外包装 进行转导,表型鉴定,核酸杂交,免疫学分析,酶切鉴定,PCR法定向扩增目的基因的基本原理PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。,第一节 PCR扩增获得目的基因或cDNA,基于PCR的分
3、离法（1）直接从基因组中扩增提取基因组DNA作模板根据目的基因序列设计引物PCR扩增适合扩增原核生物基因。真核生物基因组含有内含子！,原核基因组部分,原核细胞,提取基因组DNA,PCR扩增,基于PCR的分离法（2）从mRNA中扩增: RT-PCR提取基因组 total RNA反转录合成总cDNA作模板根据目的基因序列设计引物PCR扩增适合扩增真核生物基因。原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。,目的基因 的引物1,反转录成目的基因cDNA第一链,目的 基因cDNA第二链,PCR,mRNA,目的基因 的引物2,基于PCR的分离法（3）同源序列克隆法依据：自然界的长期进化中，一些蛋白质的
4、基因编码序列保持着高度的保守性，在生物的种属之间，基因编码序列有着很高的同源性。方法：根据同源序列设计引物进行PCR扩增，利用PCR产物进行RACE扩增或结合DNA文库进行分离目的基因。,RACE：根据已得到的不完整的cDNA序列设计引物对mRNA3端和5端进行克隆，可获得全的cDNA克隆 。（RACE克隆的意义）,cDNA末端的快速扩增（RACE）,1、根据基因编码蛋白同源序列，或多个同源基因cDNA序列设计（简并）引物，RT-PCR克隆核心序列，测序。 2、根据核心序列，设计新的引物进行cDNA的3端和5端的扩增。 3、拼接成 cDNA全序列的信息，设计新的引物扩增全长cDNA序列。,经典RACE技术流程,3 RACE：由含有oligo（dT）的接头引物引发合成cDNA第一链，根据中间核心序列设计出上游引物，与3引物扩增第一链cDNA，可得到全长cDNA的3末端序列。5 RACE：先用oligo（dT）引发合成cDNA第一链，然后在第一链cDNA的3端加上人工锚定序列，利用5锚定引物及3特异性引物进行扩增，得到全长cDNA的5末端序列。,经典RACE克隆原理,3-RACE,5RACE,在第一链cDNA的3端加上人工锚定序列,用oligo（dT）引发合成cDNA第一链,利用5锚定引物及3特异性引物进行扩增，得到全长cDNA的5末端序列,5-RACE,
