第四章 基因文库的建立.ppt

1、第四章 基因文库的建立,基因文库(gene library) 基因组文库(genomic library) cDNA文库(cDNA library),第一节 基因组文库的构建,定义：含有某种生物全部遗传信息的重组DNA分子的克隆总和。 一. 基因组文库的规模N基因组文库克隆总数 P所需机率N= f插入片段与基因组DNA长度之比二建立基因组文库的一般程序1载体DNA片段的制备DNA分离纯化 限制酶切 脱磷酸化反应2 供体DNA片段的制备 总DNA分离纯化 机械剪切法 分离特定大小DNA片段 酶法 部分酶切 分离特定大小DNA片段完全酶切,ln（1-P）,ln（1-f）,3. 供体与载体DNA连接

2、要提高重组频率，应注意连接反应体系中的总DNA浓度和两种DNA分子的克分子比率。 4. 重组DNA分子的转移和基因组文库的扩增利用转化或感染方法将连接DNA分子导入宿主细胞，让其自主复制，重组DNA分子被扩增（重组子比率可能发生变化）5. 基因组文库质量的评价1）文库规模-随机挑取一些转化子或重组子，提取质粒DNA，电泳测定插入片段大小，然后根据上述公式计算文库大小。2）重组频率-频率越高，质量越高，可大大减轻后续筛选基因工作量。,三. 利用质粒载体构建基因组文库,该法简单、快速、易于操作，但仅适合一些低等真核生物和原核生物。,四. 利用载体构建基因组文库1. 载体DNA片段的制备方法: 左右

3、臂DNA片段的获得2. 供体DNA片段的制备:限制酶部分酶切，机械剪切法3. 重组DNA分子的形成：控制克分子比率，使其形成串状DNA分子4. 重组DNA分子的包装1） DNA的包装物的制备使用的大肠杆菌菌株：E.coli BHB2688(N205 recAimm434 cItsb2 red Eam Sam/)-包装蛋白E.coli BHB2690(N205 recAimm434 cItsb2 red Dam Sam/)-头部蛋白,i. 两菌株分别培养，分别收集和制备，包装前混合-本底低（对DNA分子大小有严格限制），高效。ii. 两菌株分别培养，混合收集和制备-操作简单，本底高，可包装不同大

4、小的DNA分子。2） 重组DNA分子的包装过程包装制备物（-70）于冰上缓慢融化 加入重组DNA分子 边融化边混合边包装 离心除去细胞碎片 颗粒于-70保存待用 5. 基因组文库的扩增包装的颗粒 感染E.coli 培养 分离颗粒 -70保存,五. 利用COS质粒载体构建基因组文库构建过程与载体构建过程相似: 两臂DNA片段的制备，供体DNA片段的制备，两DNA的连接和重组DAN分子的包装。单COS质粒载体和双COS质粒载体构建基因组文库。为提高文库质量，可采取以下措施：1. 双酶切载体产生不同末端以避免其自身形成串状体2. 供体DNA脱磷酸化以避免供体DNA间的连接导致重排3. 载体和供体DN

5、A末端修饰以避免上述两种情形发生 载体DNA XhoI or SalI酶切 补CT 连接 重组DNA 供体DNA Sau3AI部分酶切 补AG4. 采用文库快速构建法以避免扩增文库时DNA丢失,利用单COS质粒载体文库,利用双COS质粒载体 构建基因组文库,六. 利用P1载体构建基因组文库构建过程也与载体构建过程十分相似: 1. 两臂DNA片段的制备: pAD10sacB BamHI/ScaI 2. 供体DNA片段的制备: 部分酶切 蔗糖梯度离心 3. 两DNA的连接和重组DAN分子的包装1) 包装物制备用菌株: E.coli NS3208=MC1061, supo recD1014 hsdR

6、- hsdM+ mcrA- mcrB- (P1 r-m- cm-2 c1.100 am10.1) : 制备pacase E.coli NS3210=MC1061, supo recD1014 hsdR- hsdM+ mcrA- mcrB- (P1 r-m- cm c1.100 am131) : 制备头部蛋白2) 重组DNA分子的包装与感染 与重组子包装相似, 然后感染E.coli NS3529 = E.coliK12 recA mcrA (hsdR hsdM mcrB mcrC mrr)(imm434 nin5X1-cre) (immLP1), 每微克DNA可在Kanr平板上4 X 105 -

7、 2 X 106 Kanr。,利用P1载体 构建基因组文库,七. 利用YAC载体构建基因组文库1. 两臂DNA片段的制备:pYAC4 BamHI/EcoRI 脱磷酸化2. 供体DNA片段的制备: 琼脂糖凝胶-DNA样品的制备 EcoRI部分酶切 脉冲场凝胶电泳 片段回收和纯化3. DNA的连接4. 重组DAN分子的转化: 原生质体转化法5. 转化子的保存: 单菌落保存于96孔平板中,酵母人工染色体构建,第二节cDNA文库的建立,定义：从一定生长阶段或条件的某种细胞分离到的全部mRNA经反转录成 cDNA后再重组和增殖所产生的无性繁殖系的总和。 一cDNA文库的特点1. 基因特异性常来自结构基因

8、，因此仅代表某种生物的一小部分遗传信息，且只代表那些正在表达的基因的遗传信息：15% mRNA，8085% rRNA，1015% tRNA2. 器官特异性不同器官或组织的功能不一样，因而有的结构基因的表达就具有器官特异性，故由不同器官提取的mRNA所组建的cDNA文库也就不同,4. 不均匀性在同一个cDNA文库中，不同类型的cDNA分子的数目是大不相同的，尽管它们都是由单拷贝基因转录而来的。这与基因组文库中的单拷贝基因均具有相同的克隆数相较，这是两种文库的另一差别。5. 各cDNA均可获得表达（一般选用的载体都是表达型的）,3. 代谢或发育特异性处于不同代谢阶段（或发育阶段）的结构基因表达亦不

9、相同,二. cDNA文库的规模N = f为某一特定cDNA（mRNA）的分子数目与全部cDNA（mRNA）分子数目之比 三. 建立cDNA文库的一般程序1. 载体DNA片段的制备2. 多聚（A）RNA的分离与纯化3. 双链cDNA 的合成1）单链cDNA 的合成：反转录法2）第二条cDNA 的合成：碱解或酶解（RNaseH）法除去RNA分子,2）同聚物加尾：可大大减少载体DNA自身连接3） cDNA的定向插入 5. 重组cDNA分子的转移和文库的建立选用载体为质粒，可直接转化E.coli；若为载体，则需进行体外包装、感染等。,4. ds- cDNA与载体DNA 相连1）人工接头：要求具平端ds

10、- cDNA，酶切时可能导致某些cDNA链断裂,cDNA文库的构建,cDNA的定向插入,四. 建立cDNA文库的特殊方法1. OkayamaBerg法1）T引物的合成：在质粒上进行，用于合成第一条cDNA链2）G引物的合成：在质粒上进行，用于合成第二条cDNA链3）第一条cDNA链合成：T引物与mRNA退火 反转录反应4）第二条cDNA链的合成：a. 第一条cDNA链3-末端加尾（dCTP）b. 限制酶切除去载体上所加的多聚C尾巴c. 与G引物退火d. 除去RNAe. 合成第二条cDNA链5）cDNA文库的形成转化该法的优点：获全长cDNA，并使cDNA表达的可能性提高一倍，因为cDNA插入方

11、向与载体上启动子方向一致。,Okayama-Berg cDNA文库构建,2. OkayamaBerg改进法该法集中了常规方法和OkayamaBerg法的优点，第一条cDNA链合成用常规法，但在3-端加尾后，其余步骤与OkayamaBerg法相同,3. SMART(Switch Mechanism At the 5 end of RNA Templates)方法 1) 当反转录酶合成到mRNA模板5端后，它会在第一链的3端加上几个C；2) 合成的寡核苷酸G与C配对；3）反转录酶以新合成的cDNA为模板，继续合成第二条cDNA链；4）LD PCRLong Distance PCR,4聚合酶链式反应法（PCR法）1) 引物的合成：T引物5-端富含GC，可提高退火温度，避免非特异性变性发生，因为3-端含低聚dTG引物5-端富含AT，便于与载体相连，3-端含低聚dG2) cDNA的PCR扩增：采用TaqDNA聚合酶，方法是：变性 与引物复性 链延伸 下一个循环3) cDNA连接方式：用匹配接头,PCR法构建 cDNA文库,