乳铁蛋白.ppt

1、乳铁蛋白,乳铁蛋白不仅参与铁的转运，而且具有广谱抗菌、抗氧化、抗癌、调节免疫系统等强大生物功能，被认为是一种新型抗菌、抗癌药物和极具开发潜力的食品和饲料添加剂。,乳铁蛋白(Lactoferrin，Lf) 是一个大约有700个氨基酸残基构成的、分子量约为80KDa的单体糖蛋白，属于转铁蛋白家族，主要由乳腺上皮细胞表达和分泌。 因其晶体呈红色，故也有学者称之为“红蛋白”。,定义,乳铁蛋白广泛分布于哺乳动物乳汁和其他多种组织及其分泌液中（包括泪液、精液、胆汁、滑膜液等内、外分泌液和嗜中性粒细胞，人乳中乳铁蛋白浓度约为1.0-3.2mg/ml，是牛乳中的10倍（牛乳中含量为0.02-0.35mg/ml

2、），占普通母乳总蛋白的20%。,分 布,血液中乳铁蛋 白主要来自中性白细胞，骨髓、子宫内膜及胎盘等也能分泌少量的乳铁蛋白进入血液 。,人在泌乳期间，乳铁蛋白含量随着泌乳时间的不同而发生变化，如人初乳中乳铁蛋白可达6-14mg/ml，常乳期降至1mg/ml。,乳铁蛋白由700个左右的氨基酸组成。人乳铁蛋白分子量为82.4KDa，有692个氨基酸残基；牛乳铁蛋白分子量为83.1KDa，由689个氨基酸组成。,乳铁蛋 白 N 端 (1 338) 与 C 端 (339 692) 两个球状结构相应位置上有 37 (125 个) 的氨基酸完全相同。,结构及性质,人乳铁蛋白与牛乳铁蛋白结构相似，氨基酸残基组

3、成单链，两端折叠成球形(N叶和 C 叶)，中间由一段螺旋肽链连接呈现“二枚银杏叶型”结构。,在晶体结构中Phe17Leu29间肽链形成-螺旋结构，Ser33Arg39间无规则卷 曲结构并使一个平行 -折叠结构与N 端相连。Phe17 Leu29间肽段具有较强 的抗菌活性，如果将其a -螺旋变成-折叠结构抗菌活性有较大提高，可能是由于-折叠结构易于细菌表面接触的缘故。,每个分子中有2个金属结合位点，每个位点可结合一个Fe3+ 和 一 个HCO3- 或 CO32-,乳铁蛋白对胰蛋白酶类具有很强的抗降解能力，尤其是结合铁离子后抗降解能力增强，因此在肠道内不易被降解，能以完整分子的形式被吸收。这种抗蛋

4、白酶水解的特性可能与糖基化有关 。,在铁离子结合结构域中包括三个阴离子配子体(两个酪氨酸残基，一个天冬氨酸残基)和一个组氨酸残基，可与铁离子形成稳定的结合。,在酸性条件下对热稳定; 在碱性条件下,高于80即开始凝胶化。,根据Lf结合Fe的多寡，可将其分为缺铁型乳铁蛋白(apoLf)、铁半饱和型乳铁蛋白和 铁饱和型乳铁蛋白(Holoix)三种形式。不同形式的Lf具有不同的抗变性能力，其抗巴 氏杀菌热变性能力依次为：Holoix 铁半饱和型乳铁蛋白 apoLf 。,牛乳Lf的等电点pH值为8.2左右，人Lf的等电点为6左右。,1、乳 铁 蛋 白具 有 广 谱 抗 菌 作 用,Lf抑菌效果取决于微生

5、物对铁的需求程度、外源铁的生物利用率、Lf的铁饱和度 、 盐类、pH值、抗体或其他免疫物质、介质等。,生物学功能,首 先 ， Lf 对 革 兰 氏 阴 性 菌 和 阳 性 菌 的 抑 菌 作 用 是 由于 乳 铁 蛋 白 高 度 结 合 铁 ， 使 细 菌 失 去 生 长 所 需 的 基本 元 素 铁 ；其 次 ， L f 通 过 氨 基 末 端 强 阳 离 子 结 合 区域 ，增 加 细 菌 细 胞 膜 的 通 透 性 ， 使 细 菌 的 脂 多 糖 从外 膜 渗 出 ，达 到 直 接 杀 菌 作 用； 另 外 ， Lf 可 通 过水 解 得 到 的 抗 菌 肽 来 实 现 抗 菌 作 用。

6、 将 Lf 通 过蛋 白 酶 水 解 获 得 一 些 低 分 子 量 的 肽 ， 这 些 肽 的 抗 菌活 性 大 幅 度 增 强 ， 可 抑 制 G+ 和 G- 菌 生 长 ， 其 中 包括 一 些 对 Lf 具 有 抵 抗 性 的 菌 株 。,目 前 认 为 Lf 的 抗 菌 机 理 可 能 有 以 下 3 个 方 面 ：,2、乳 铁 蛋 白 具 有 抗 病 毒 作 用,天 然 的 Lf 能 够 抑 制 人 免 疫 缺 陷 病 毒 和 巨 细 胞 病 毒 对 M T4 细 胞 和 成 纤 维 细 胞 的 病 变 作 用 ， 此 外 ， 还 具 有 抑 制 流 感 病 毒 的 活 性 ， 主

7、 要 是 因 为 其 碳 水 化 合 物 残 基 上 含 唾 液 酸 ， 它 干 扰 病 毒 对 靶 细 胞 的 结 合 和 侵 染。 乳 铁 蛋 白 通 过 抑 制 病 毒 进 入 细 胞 ， 减 轻 对 人 体 肝 细 胞 的 损 害。,3、乳 铁 蛋 白 具 有 抗 氧 化 作 用,研 究 结 果 显 示 ， 乳 铁 蛋 白 能 抑 制 铁 诱 导 的 脂 质 过 氧 化 过 程 所 产 生 的 硫 代 巴 比 妥 酸 和 丙 二 醛 的 生成 。 另 外 ， 牛 乳 铁 蛋 白 能 降 解 酵 母 中 的 tR N A ，具 有 核 糖 核 酸 酶 的 活 性 ， 且 能 抑 制 超

8、氧 离 子 的 形 成 。 所有 这 些 都 可 降 低 人 体 内 自 由 基 对 动 脉 血 管 壁 弹 性 蛋 白 的 破 坏 ， 达 到 预 防 和 治 疗 动 脉 粥 样 硬 化 和 冠 心 病 的 目 的,4、乳 铁 蛋 白具 有 抗 癌 作 用,乳 铁 蛋 白 对 消 化 道 肿 瘤 ， 如 结 肠 癌 、 胃 癌 、 肝 癌 、 胰 腺 癌 ， 具 有 化 学 预 防 作 用 ， 并 可 抑 制 由 此 引 发 的 肿 瘤 转 移 。 另 外 ， 乳 铁 蛋 白 在 启 动 宿 主 防 御 系 统 的 初 始 活 化 反 应 ， 调 控 不 同 类 型 淋 巴 细 胞 比 例

9、的 改 变 对 机 体 免 疫 反 应 的 影 响 ， 提 高 免 疫 力 等 方 面 都 起 到 了 促 进 作 用 。,5、乳 铁 蛋 白 调 节 机 体 免 疫 反 应,乳 铁 蛋 白 具 有 调 节 巨 噬 细 胞 活 性 和 刺 激 淋 巴 细 胞 合 成 的 能 力 ； 而 且 嗜 中 性 粒 细 胞 是 含 乳 铁 蛋 白 最 多 的 细 胞 ， 在 机 体 受 感 染 时 可 以 将 乳 铁 蛋 白 释 放 出 来 ， 释 放 出 的 乳 铁 蛋 白 夺 取 致 病 菌 的 铁 离 子 致 使 后 者 死 亡 。 另 外 ， 经 研 究 显 示 ， 乳 铁 蛋 白 对 抗 体

10、生 成 、T 细 胞 成 熟 、 淋 巴 细 胞 中 自 然 杀 伤 细 胞 比 例 都 具 有 调 节 作 用,6、乳 铁 蛋 白 调 节 胃 肠 道 铁 的 吸 收,乳 铁 蛋 白 通 过 它 的 氨 基 和 羧 基 末 端 两 个 铁 结 合 区 域 能 高 亲 和 性 地 ， 可 逆 地 与 铁 结 合 ， 并 维 持 铁 元 素 在 一 个 较 广 的 p H 值 范 围 内 完 成 铁 在 十 二 指 肠 细 胞 的 吸 收 和 利 用 。,7、乳 铁 蛋 白 同 药 物 的 协 同 作 用,研 究 显 示 ， 乳 铁 蛋 白 能 同 多 种 抗 生 素 和 抗 病 毒 药 物 协

11、 同 作 用 ， 减 少 药 物 用 量 ， 降 低 抗 生 素 或 抗 真 菌 制 剂 对 人 肝 。 肾 功 能 的 损 害 。 同 时 ， 增 强 体 内 微 生 物 对 药 物 的 敏 感 性 。,影 响 Lf 功 能 的 因 素,实验证明，婴儿或仔畜出生初期，Lf降解程度很低，随后迅速升高，生理功能也逐渐消失。 Lf的抑菌作用具有很强的铁依赖性，只有在其处于不饱和状态时，才具有较强的抑菌能力，而在Lf呈铁饱和状态时，抑菌作用也不复存在。 pH值也影响Lf的活性，在pH中性环境中，Lf活力较强，当pH 6 时，则基本无抑菌功能。 盐的种类明显影响Lf的抑菌能力，碳酸盐可增强Lf的抑菌作

12、用，而柠檬酸盐则会减弱 Lf的抑菌作用， 肠液内存在 HC03一， 因此有利于Lf发挥抑菌功能。 此外， 抗体或其他免疫物质也会影响Lf的抑菌能力，例如，Lf和初乳中的IgA 、 IgG就具有协同抑菌的作用。,Lf只有在维持其活性不被降解的前提下，才能发挥生理功能。,乳铁蛋白的生产制备方法,牛初乳富含LF,可采用色谱法、超滤法、盐析法、酸沉淀法等方法从初乳中提取乳铁蛋白。,牛初乳经冷冻离心机脱脂 ,35下加入适当稀释的皱胃酶液 ,分离去除酪蛋白. 微滤后即为用于超滤研究的物料. 用 MWCO为100000的超滤膜进行首次超滤 ,透过液再用MWCO为50000的超滤膜进行第二次超滤 ,然后用 M

13、WCO为10000的超滤膜进行浓缩 ,冷冻干燥 ,即得到Lf 的粗品.,超滤法：,Lf的分离纯化及检测方法,目 前 鉴 定 乳 铁 蛋 白 的 方 法主 要 有 ： 免 疫 双 扩 散 法 、酶 联 免 疫 检 测 法 (E L ISA ),反相高效液相色谱法等,反相高效液相色谱法测定牛初乳中乳铁蛋白含量,色谱条件 色谱柱：Kromasil C4色谱柱（250mm*4.6mm,5m）。流动相：乙腈-水-三氟乙酸（80:20:0.1)流速0.6mL/min;检测波长:220nm,柱温：25；进样量10.0L,样品溶液的制备 量取新鲜牛初乳离心除脂肪，得到的脱脂乳调pH值至4.6，离心除酪蛋白，收

14、集乳清，然后调pH值至6.8，加硫酸铵使饱和度达到40%，离心取乳清液，用截留分子量为300Ku、100Ku、30Ku的超滤膜包进行超滤，收集30Ku膜包超滤后的回留液进行离子交换层析，收集洗脱峰，即为样品溶液。,精密称取乳铁蛋白标准品1mg,配制浓度分别为1、0.5、0.25、0.125、0.05、0.025mg/mL的对照品溶液。,乳铁蛋白进样量浓度在25-1000g/mL时，线性关系良好。,取样品进行RP-HPLC检测。如图3所示为离子交换层析后收集各洗脱峰，其中峰1、2为未吸附蛋白流穿液，峰3为低盐浓度洗脱液，峰4为高盐浓度洗脱液，即提取的乳铁蛋白洗脱液。图4为峰4洗脱液经RP-HPL

15、C检测结果。结果显示牛初乳经除脂肪、除酪蛋白、超滤和离子交换层析后，提取的乳铁蛋白的平均纯度为92.23%，RSD为1.3%。,作为一种高效补铁组分，Lf可用作食品添加剂，以改变婴幼儿及孕妇普遍缺铁的现状 ， 也可制成含铁饮料或补铁胶囊，用来提高造血功能，改善贫血。 在食品或乳制品(如婴幼儿奶粉)甚至口香糖中，添加Lf可调节免疫功能。 国外在乳制品中补充益生菌和Lf，制成片剂或速溶饮料，作为运动员的营养品。 把Lf添加到碳酸饮料、焙烤食品中既具营养价值，又可增进消化功能。 在肉食生产中，可利用 Lf抑制产品表面因人手接触等原因而滋生的有害细菌。 在玉米油乳化体系及卵磷脂脂质体系中Lf具有抗氧化功能。实验证明， Lf可改进大豆油粉末的保质期。 总之，Lf因其具有多种生理活性功能，在乳品、食品、生化、医药、化妆品等领域已得到广泛应用，其开发前景不可限量,乳铁蛋白的应用,感谢您的关注！,