CNS 9534-2004 Method of test for Lincomycin in feeds《饲料中林可霉素检验方法》.pdf

1、 1 印行年月 94 年 10 月 本標準非經本局同意不得翻印 中華民國國家標準 CNS 總號 類號 ICS 65.120 N41049534經濟部標準檢驗局印行 公布日期 修訂公布日期 71 年 10 月 12 日 93 年 10 月 20 日 (共 5 頁 )飼料中林可黴素檢驗方法 Method of test for Lincomycin in feeds 1. 適用範圍：本標準規定飼料中林可黴素（ Lincomycin）之檢驗方法。 2. 原理：飼料中林可黴素，以乙腈二次萃取後，使用生物分析法測定。 3. 檢驗方法 3.1 工作環境：工作平檯須寬敞、潔淨，光線良好操作平檯光度為 100

2、 呎燭光（ cd；candela），密閉室內換氣良好，儘可能沒有灰塵及流動空氣。微生物密度之要求為每 15 分鐘落菌數不得超過 15 CFU /培養皿。 3.2 器具及材料 3.2.1 離心機 (Centrifuge)：轉速可至 4,000 rpm 者。 3.2.2 離心管（ Centrifuge tube）：玻璃或塑膠製品，容量為 50 mL。 3.2.3 酸鹼值測定儀 (pH meter) 3.2.4 離心管振盪器（ Shaker） 3.2.5 冰箱：能維持 41者。 3.2.6 培養箱：能維持內部溫差在 1以內者。 3.2.7 微量吸管（ Micropipette）： 20 L、 100

3、 L、 200 L 及 1000 L。 3.2.8 吸管：已滅菌， 1 mL 者應有 0.01 mL 之刻度； 5 及 10 mL 者應有 0.1 mL 之刻度。 3.2.9 培養皿：已滅菌，內徑約 9 cm，高約 20 cm，底皿內外平坦、無氣泡、刮傷或其他缺點者。 3.2.10 乾熱滅菌器 (Oven)：內部中心溫度能達 170以上者。 3.2.11 高壓滅菌釜 (Autoclave)：能適用 121 (約 15 lb/in2或 1 kg/cm2)滅菌 15 分鐘以上者。 3.2.12 不銹鋼圓筒（ Stainless cup or cylinder）：規格外徑 80.1 mm，內徑 60

4、.1 mm，高 100.1mm。 3.2.13 抗生素抑菌圈測讀計（ Antibiotic zone reader） ：可供量取抑菌圈之直徑者。若無本器，可使用游標尺或其他量尺。 3.2.14 生物分析盤（ Bioassay plate）：長 24.3 cm，寬 24.3 cm，深 1.8 cm。 3.2.15 薄層層析板（ Thin layer chromatography plate, TLC） ：長 20 cm，寬 20 cm，厚 250 m 矽膠層析板（ Merck 1.05553）。 3.2.16 展開槽（ Developing chamber）：玻璃製品槽底需平坦，供 TLC 板展

5、開用。 3.2.17 試驗菌： Staphylococcus luteus ATCC 9341a（ CCRC 11541）。 3.2.18 試藥：鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、氫氧化鉀、氯仿、甲醇、乙腈、正丙醇、林可黴素對照用標準品。 2 CNS 9534, N 4104 3.3 緩衝溶液之配製 pH8.0 磷酸鹽緩衝溶液： 13.3 g KH2PO4 6.2 g KOH 溶解於 900 mL 蒸餾水中，以 HCl 調 pH 至 8.00.1，然後稀釋至 1L。 3.4 展開液之配製 氯仿：甲醇 8： 2 (v/v)，定容至 100 mL。 3.5 培養皿 3.5.1 抗生素培養皿 1 號（ A

6、ntibiotic Medium 1） 蛋白 (Peptone) 6.0 g 胰消化酪蛋白（ Pancreatic digest of casein 4.0 g 酵母抽出物（ Yeast extract） 3.0 g牛肉抽出物（ Beef extract） 1.5 g葡萄糖（ Dextrose） 1.0 g 洋菜（ Agar） 15.0 g蒸餾水加至 1000 mL加熱溶解後，以 121滅菌 15 分鐘後，作成斜面培養皿，最終 pH 值為 6.5 0.1，於滅菌後冷卻至約 48後，作成斜面培養皿供試驗菌繼代保存用。 3.5.2 抗生素培養皿 11 號（ Antibiotic Medium 11

7、） 蛋白 (Peptone 6.0 g 胰消化酪蛋白（ Pancreatic digest of casein） 4.0 g 酵母抽出物（ Yeast extract） 3.0 g牛肉抽出物（ Beef extract） 1.5 g葡萄糖（ Dextrose） 1.0 g 洋菜（ Agar） 15.0 g蒸餾水加至 1000 mL加熱溶解後，以 121滅菌 15 分鐘，最終 pH 值為 8.00.1。滅菌後待冷卻至約 48，加入試驗菌液，均勻混合，培養皿每只分裝 10 mL 於平坦檯面自然凝固備用。 3.6 試驗菌液之製備：試驗菌以抗生素培養皿 1 號於 30培養 171 小時。使用時，調其菌

8、液濃度使添加於培養皿後，於高倍稀釋之標準溶液（ 0.5 g/mL）呈現直徑約 10 mm 之抑菌圈，於低倍稀釋之標準溶液（ 6.0 g/mL）呈現直徑約 2530 mm 之抑菌圈（試驗菌液於冰箱中保存不可超過 2 週）。 3.7 培養皿 3.7.1 底層：加入 10 mL 之抗生素培養皿 1 號。 3.7.2 種層：加適量之試驗菌液於滅菌後待冷卻至約 48之抗生素培養皿 11 號，然後取 4 mL 於含有底層之培養皿，以傾斜圓轉之動作搖動培養皿使其分布均勻，待其自然凝固。培養皿需在製備當日使用。 3.8 標準溶液 3.8.1 原液：正確秤量標準林可黴素，以 pH8.0 磷酸鹽緩衝溶液溶解定容，

9、使其 3 CNS 9534, N 4104 濃度為 1000 g/mL。儲存於 2 10， 2 週內有效。 3.8.2 標準曲線：以 pH8.0 磷酸鹽緩衝溶液將原液稀釋，使其濃度為 0.5、 1.0、2.0、 4.0 及 6.0 g/mL 之標準溶液，其中 2.0 g/mL 為參比濃度（ Reference concentration）。 3.9 標準曲線之製作 3.9.1 使用圓筒置放器 (Cup dropper)將經滅菌之不銹鋼圓筒投放於定量用培養皿上，每個培養皿放置 6 個圓筒 (或以滅菌過之鑷子取滅菌不銹鋼圓筒，在定量用培養皿上按 60 度圓心角放置六枚 )。 3.9.2 該種抗生素

10、之每種濃 度，使用三個定量用培養皿 (參比濃度除外 )，因此該抗生素五種不同濃度共需 12 個定量用培養皿。 3.9.3 在每種濃度所需的 3 個定量用培養皿內，於每間隔一個圓筒中注入該種抗生素之參比濃度溶液，剩餘 3 個圓筒則注入該濃度的抗生素液，每個圓筒注入量 320 L 或適當定量。 3.9.4 於 301之恆溫箱中培養 171 小時後，以抗生素抑菌圈測讀計或游標卡尺測量其抑菌圈直徑之大小。 3.9.5 量取該種抗生素同一濃度之 9 個圓筒抑菌圈平均值及 9 個該種抗生素參比濃度之抑菌圈平均值。 3.9.6 求取該種抗生素參比濃度 36 個圓筒之抑菌圈平均值，做為該抗生素標準曲線之修正點

11、（ Correction point）。 3.9.7 以該抗生素之修正點和該抗生 素參比濃度抑菌圈平均值之差數，做為修正該抗生素各個濃度抑菌圈平均值之依據（如當修正點為 20.0 mm，參比濃度抑菌圈平均值為 19.8 mm，二者之差為 0.2 mm，標準溶液抑菌圈直徑平均值若為 17.0 mm，則修正為 17.2 mm）。 3.9.8 將修正過的各抗生素 不同濃度之抑菌圈修正值 (包括修正點 )在半對數函數表上，繪出標準曲線（亦可利用電腦軟體繪出）。 3.9.9 該曲線的最低濃度抑菌圈 (L)及最高濃度抑菌圈 (H)可由下列公式計算出： L (3a 2b c e)/5 H (3e 2d c

12、a)/5 a,b,c,d,e 分別代表修正後之各濃度抑菌圈值， c 為 36 個參比濃度抑菌圈之平均值即為修正點， a 為最低濃度， e 則為最高濃度。 3.10 檢液之調製 3.10.1 秤取 5.0 g 樣品，置入離心管內，加乙腈 20 mL，振盪 10 分鐘，再以 3,000 rpm 離心 10 分鐘後，取上清液。 3.10.2 殘渣再加入 20 mL 乙腈，振盪 10 分鐘，再以 3,000 rpm 離心 10 分鐘後，取上清液。 3.10.3 合併二次之上清液，於 45以下減壓濃縮至乾。 3.10.4 以 pH8.0 磷酸鹽緩衝溶液定量 5 mL，供圓筒平板法之檢液用。 3.10.5

13、 若生物分析法之結果抑菌圈大於 12 mm 則判為陽性，重複第 3.11.1 節至 4 CNS 9534, N 4104 第 3.11.3 節之步驟，以甲醇 0.5 mL 溶出，供作生物自析鑑別法（ Bioautography）之測定用。 3.11 圓筒平板法（ Cylinder plate method） 3.11.1 將經滅菌之不銹鋼圓筒投放於含試驗菌之培養皿上，按 60 度圓心角放置 6 個圓筒。 3.11.2 取上述培養皿 3 個，使用微量吸管定量吸取樣品檢液 320 L，分別注入於每個培養皿上之 3 個間隔圓筒內。 3.11.3 另外 3 個圓筒內則分別注入林可黴素參比濃度標準溶液各

14、 320 L。 3.11.4 於 301恆溫箱中培養 171 小時後，以抗生素抑菌圈測讀 計或游標卡尺，測定樣品檢液 (共 9 個值 )及抗生素參比濃度 (每皿 3 個值 )之圓筒抑菌圈平均值，並記錄結果。 3.11.5 若檢液無明顯抑菌圈（直徑小於 12 mm）時，則表示該樣品無林可黴素之殘留；有明顯抑菌圈（直徑 12 mm）以上時，則繼續進行下述之操作。 3.12 生物自析鑑別法（ Bioautography） 3.12.1 於距薄層層析板 (TLC 板 )下端 2 公分處，分別設定樣品檢液及抗生素標準液之原點，點間距離 2 公分。 3.12.2 於設定之原點上，以微量吸管分別注入檢液及林

15、可黴素標準溶液各 30 L於薄層層析板，並吹乾。 3.12.3 將薄層層析板放入展開槽中，以展開液展至原點上方 15 公分處，取出以電扇風乾至少 30 分鐘。 3.12.4 取 No.11 抗生素培養皿 100 mL，經滅菌冷卻至 50，加入適量芽胞懸浮液（添加量可參照培養皿之配製），充分搖勻後，注入經滅菌之生物分析盤中，並於平坦之檯面上靜置固化。 3.12.5 將風乾之薄層層析板密貼在上述生物分析盤內之培養皿上，排除接觸面之氣泡，加皿蓋置於室溫下使其擴散約 30 分鐘後，將薄層層析板移去。 3.12.6 將生物分析盤移入 301恆溫箱中培養 171 小時。 3.12.7 以一透明膠紙放在培養

16、皿表面將各個圓 點及抑菌點之位置及範圍用油性簽字筆（奇異筆）描繪出。 3.12.8 以小量尺 量取標準抗生素及樣品抑菌點中心到原點之高度求出 Rf值，加以記錄。當樣品抑菌點之 Rf值和林可黴素標準溶液之 Rf值相同時，即可確認該種抗生素之殘留。 3.13 回收率試驗：分別添加 100 g/mL 林可黴素標準溶液 100 及 250 L 於檢體 5 g中，使添加濃度分別為 2 及 5 g/g，作三重複試驗。依第 3.10 節調製檢液，再以第 3.11 節分別測量其抑菌圈直徑。並以下列公式計算，求得檢體之回收率。 各添加濃度之檢體回收率（ %） A/B100 A：各添加濃度之檢液所產生之抑菌圈直徑平均值 B：各添加濃度之標準溶液所產生之抑菌圈直徑平均值 5 CNS 9534, N 4104 檢體平均回收率為 2 個添加濃度檢體回收率之平均值。 3.14 林可黴素殘留量之計算：以林可黴 素標準曲線之參比濃度修正點和參比濃度抑菌圈直徑平均值之差，修正林可 黴素參比濃度之抑菌圈平均值並計算出該樣品抑菌圈修正值，再依下列公式計算，以求得該樣品之抗 生素實際殘留量。 檢體中林可黴素殘留量（ ppm） SR S：標準曲線上求得之檢體殘留林可黴素濃度（ ppm） R：該類空白檢體添加林可黴素試驗平均回收率（ %） 備考：本檢驗方法之最低檢出限量為 2 ppm。