CNS 9535-2004 Method of test for Neomycin in feeds《饲料中新霉素检验方法》.pdf

1、 1 印行年月 94 年 10 月 本標準非經本局同意不得翻印 中華民國國家標準 CNS 總號 類號 ICS 65.120 N41059535經濟部標準檢驗局印行 公布日期 修訂公布日期 71 年 10 月 12 日 93 年 10 月 20 日 (共 5 頁 )飼料中新黴素檢驗方法 Method of test for Neomycin in feeds 1. 適用範圍：本標準規定飼料中新黴素（ Neomycin）之檢驗方法。 2. 原理：飼料中新黴素，以含 0.01M Na2EDTA (disodium ethylenediamine tetraacetate)之 pH4.0 MacIlv

2、aine 緩衝溶液萃取後，經 COOH 型萃取管柱純化後，使用生物分析法測定。 3. 檢驗方法 3.1 工作環境：工作平檯須寬敞、潔淨，光線良好操作平檯光度為 100 呎燭光（ cd；candela），密閉室內換氣良好，儘可能沒有灰塵及流動空氣。微生物密度之要求為每 15 分鐘落菌數不得超過 15CFU/培養皿。 3.2 器具及材料 3.2.1 離心機 (Centrifuge)：轉速可至 4,000 rpm 者。 3.2.2 離心管振盪器（ Shaker） 3.2.3 酸鹼值測定儀 (pH meter) 3.2.4 離心管（ Centrifuge tube）：玻璃或塑膠製品，容量為 50 mL

3、。 3.2.5 微量吸管（ Micropipette）： 20 L、 100 L、 200 L 及 1000 L。 3.2.6 培養皿：已滅菌，內徑約 9 cm，高約 20 cm，底皿內外平坦、無氣泡、刮傷或其他缺點者。 3.2.7 乾熱滅菌器 (Oven)：內部中心溫度能達 170以上者。 3.2.8 高壓滅菌釜 (Autoclave)：能適用 121 (約 15 lb/in2或 1 kg/cm2)滅菌 15 分鐘以上者。 3.2.9 不銹鋼圓筒 (Stainless cup or cylinder)：規格外徑 80.1mm，內 徑 60.1 mm，高 100.1mm。 3.2.10 抗生素

4、抑菌圈測讀計 (Antibiotic zone reader)：可供量取抑菌圈之直徑者。若無本器，可使用游標尺或其他量尺。 3.2.11 生物分析盤（ Bioassay plate）：長 24.3 cm，寬 24.3 cm，深 1.8 cm。 3.2.12 展開槽（ Developing chamber）：玻璃製品槽底需平坦，供 TLC 板展開用。 3.2.13 薄層層析板 (Thin layer chromatography plate, TLC)：長 20 cm，寬 20 cm，厚 250 m 矽膠層析板（ Merck 1.05552）。 3.2.14 COOH 型萃取管柱（ Carbox

5、ylic acid extraction column）： 500 mg。 3.2.15 試驗菌： Staphylococcus epidermidis ATCC 12228（ CCRC 11030）。 3.2.16 展開液： 6.8 g 無水磷酸氫二鉀及 2.0 g 無水磷酸二氫鉀溶解於 90 mL 蒸餾水，調 pH 至 7.00.1，定量至 100 mL。 2 CNS 9535, N 4105 3.2.17 試藥：無水磷酸氫二鉀、 無水磷酸二氫鉀、氯化鈉、氫氧化鉀、檸檬酸、Na2EDTA、無水磷酸氫二鈉均採試藥級，硫酸新黴素 (Neomycin sulfate)對照用標準品。 3.3 緩衝

6、溶液之配製 3.3.1 pH8.0 磷酸鹽緩衝溶液： 16.73 g 無水磷酸氫二鉀及 0.523 g 無水磷酸二氫鉀溶解於 900 mL 蒸餾水，調 pH 至 8.00.1，然後稀釋至 1L。以 121滅菌15 分鐘。 3.3.2 0.1M 檸檬酸溶液：秤取檸檬酸 2.1 g，以蒸餾水定容至 100 mL。 3.3.3 0.2M 磷酸氫二鈉溶液：秤取無水磷酸氫二鈉 2.84 g，以蒸餾水溶解定容至100 mL。 3.3.4 pH4.0 MacIlvaine 緩衝溶液：取 0.1M 檸檬酸溶液 12.3 mL 和 0.2M 磷酸氫二鈉溶液 7.7 mL 混合後調整 pH 值至 4.0，以 12

7、1滅菌 15 分鐘後放冷備用。 3.3.5 含 0.01M Na2EDTA 之 pH4.0 MacIlvaine 緩衝溶液：取 Na2EDTA 3.72 g，以pH4.0 MacIlvaine 緩衝溶液溶解，定容至 1000 mL，以 121滅菌 15 分鐘後放冷備用。 3.3.6 pH3.0 MacIlvaine 緩衝溶液：取 0.1M 檸檬酸溶液 15.9 mL 和 0.2M 磷酸氫二鈉溶液 4.1mL 混合後調整 pH 值至 3.0，以 121滅菌 15 分鐘後放冷備用。 3.4 培養皿 3.4.1 抗生素培養皿 1 號（ Antibiotic Medium 1） 蛋白 (Peptone

8、) 6.0 g 胰消化酪蛋白（ Pancreatic digest of casein） 4.0 g酵母抽出物（ Yeast extract） 3.0 g牛肉抽出物（ Beef extract） 1.5 g 葡萄糖（ Dextrose） 1.0 g洋菜（ Agar） 15.0 g蒸餾水加至 1000 mL加熱溶解後，以 121滅菌 15 分鐘後，作成斜面培養皿，最終 pH 值為6.50.1。滅菌後待冷至約 50後，作成斜面培養皿供試驗菌繼代保存用。 3.4.2 抗生素培養皿 11 號（ Antibiotic Medium 11） 蛋白 (Peptone) 6.0 g 胰消化酪蛋白（ Pancr

9、eatic digest of casein） 4.0 g酵母抽出物（ Yeast extract） 3.0 g牛肉抽出物（ Beef extract 1.5 g 葡萄糖（ Dextrose） 1.0 g洋菜（ Agar） 15.0 g蒸餾水加至 1000 mL加熱溶解後，以 121滅菌 15 分鐘，最終 pH 值為 8.00.1。滅菌後待冷卻 3 CNS 9535, N 4105 至約 48，加入試驗菌液，均勻混合，培養皿每只分裝 10 mL 於平坦檯面自然凝固備用。 3.5 試驗菌液之製備：試驗菌以抗生素培養皿 1 號於 30培養 171 小時。使用時，調其菌液濃度使其添加於培養皿後，於高

10、倍稀釋之標準溶液（ 0.125 g/mL）呈現直徑約 10 mm 之抑菌圈，於低倍稀釋之標準溶液（ 2.0 g/mL）呈現直徑約20 25 mm 之抑菌圈（試驗菌液於冰箱中保存不可超過 2 週）。 3.6 培養皿：加適量之試驗菌液於剛融解並冷卻至約 48之抗生素培養皿 11 號，然後取 10 mL 於培養皿，以傾斜圓轉之動作搖動培養皿使其分布均勻，待其自然凝固。培養皿需在製備當日使用。 3.7 標準溶液 3.7.1 原液：正確稱量標準硫酸新黴素，以 pH8.0 磷酸鹽緩衝溶液溶解定容，使其濃度為 1000 g/mL。儲存於 2 10， 4 週內有效。 3.7.2 標準曲線：以 pH8.0 磷酸

11、鹽緩衝溶液將原液稀釋，使其濃度為 0.125、 0.25、0.5、 1.0 及 2.0 g/mL 之標準溶液。 3.8 標準曲線之製作 3.8.1 無菌操作夾取經滅菌之不銹鋼圓筒投放於定量用培養皿上，按 60 度圓心角放置六枚。 3.8.2 每一濃度之硫酸新黴素標準溶 液，使用三個定量用培養皿，四種不同濃度（參比濃度除外）共需 12 個定量用培養皿。 3.8.3 於每個培養皿上放置之 6 個圓筒相間之 3 個圓筒內注入標準溶液，其餘 3個圓筒注入參比濃度標準溶液，注入量為 320 L 或適當定量。 3.8.4 於 361培養 171 小時後，以抗生素抑菌圈測讀計或游標卡尺測量其抑菌圈直徑。 3

12、.8.5 量取同一濃度標準溶液之 9 個抑菌圈直徑及 9 個參比濃度之抑菌圈直徑，分別計算其平均值。 3.8.6 求取參比濃度 36 個抑菌圈平均 值，以此做為該抗生素標準曲線之修正點（ Correction point）。 3.8.7 以修正點和該抗生素參比濃度 抑菌圈直徑平均值之差，調整各標準溶液抑菌圈平均值，每一標準溶液因 此可得一修正抑菌圈直徑平均值（如當修正點為 20.0 mm，參比濃度抑菌圈平均值為 19.8 mm，二者之差為 0.2 mm，標準溶液抑菌圈直徑平均值若為 17.0 mm，則修正為 17.2 mm） 3.8.8 在半對數函數表上，以四種濃 度之標準溶液修正抑菌圈直徑平

13、均值及修正點為橫軸（自然數值），濃度為縱軸（對數值），繪出標準曲線。 3.8.9 該標準曲線最低濃度抑菌圈直徑平均值 (L)及最高濃度 抑菌圈直徑平均值(H)可由下列公式計算出： L (3a 2b c e)/5 H (3e 2d c a)/5 a,b,d,e 為低至高濃度標準溶液之修正抑菌圈直徑平均值， c 為 36 個參比濃 4 CNS 9535, N 4105 度抑菌圈之平均值（修正點）。 3.9 檢液之調製 3.9.1 稱取 10.0 g 樣品，置入離心管內。 3.9.2 加入 20 mL 含 0.01M Na2EDTA 之 pH4.0 MacIlvaine 緩衝溶液，振盪 15 分鐘。

14、 3.9.3 以 2,500 3,000 rpm 離心 15 分鐘後，取上層液加入正己烷 10 mL，振盪 10分鐘。 3.9.4 以 2,500 3,000 rpm 離心 15 分鐘後，收集水層 (下層 )，加氯仿 20 mL。 3.9.5 振盪 10 分鐘，以 2,500 3,000 rpm 離心 15 分鐘後，收集水層 (上層 )。 3.9.6 注入已活化之 COOH 型萃取管柱，俟其完全流出後，以 4 mL 之 pH3.0 MacIlvaine 緩衝溶液沖提，再以 5N NaOH 調 pH 至 7.5，供作檢液。 3.10 COOH 型萃取管柱之活化：取 COOH 型萃取管柱先以正己烷

15、 5 mL 通過後，抽氣 1 分鐘除去正己烷，再依序以甲醇、蒸餾水及 pH4.0 MacIlvaine 緩衝溶液各5 mL 通過管柱 (流速約為 1.5 mL/min)。進行檢體分析前管柱必須浸於 pH4.0 MacIlvaine 緩衝溶液中保濕。 3.11 圓筒平板法（ Cylinder plate method） 3.11.1 將經滅菌之不銹鋼圓筒投放於含試驗菌之培養皿上，按 60圓心角放置 6個圓筒。 3.11.2 取上述培養皿 3 個，使用微量吸管定量吸取樣品檢液 320 L，分別注入於每個培養皿上之 3 個間隔圓筒內。 3.11.3 另外 3 個圓筒內則分別注入新黴素參比濃度標準溶液

16、各 320 L。 3.11.4 於 361恆溫箱中培養 171 小時後，以抗生素 抑菌圈測讀計或游標卡尺，測定樣品檢液（共 9 個值）及抗生素參比濃度（每皿 3 個值）之圓筒抑菌圈平均值，並記錄結果。 3.11.5 若檢液無明顯抑菌圈（直徑小於 12 mm）時，則表示該樣品無新黴素之殘留；有明顯抑菌圈 (直徑 12 mm 以上 )時，則繼續進行下述之操作。 3.12 生物自析鑑別法 (Bioautography) 3.12.1 於距薄層層析板 (TLC 板 )下端 2 公分處，分別設定樣品檢液及抗生素標準液之原點，點間距離 2 公分。 3.12.2 於設定之原點上，以微量吸管分別注入檢液及新黴

17、素標準溶液各 30 L 於薄層層析板，並吹乾。 3.12.3 將薄層層析板放入展開槽中，以展開液展至原點上方 15 公分處，取出以電扇風乾至少 30 分鐘。 3.12.4 取 No.11 抗生素培養皿 100 mL，經滅菌冷卻至 48，加入適量芽胞懸浮液（添加量可參照培養皿之配製），充分搖勻後，注入經滅菌之生物分析盤中，並於平坦之檯面上靜置固化。 3.12.5 將風乾之薄層層析板密貼在上述生物分析盤內之培養皿上，排除接觸面之氣泡，加皿蓋置於室溫下使其擴散約 30 分鐘後，將薄層層析板移去。 5 CNS 9535, N 4105 3.12.6 將生物分析盤移入 361恆溫箱中培養 171 小時。

18、 3.12.7 以一透明膠紙放在培養皿表 面將各個圓點及抑菌點之位置及範圍用油性簽字筆（奇異筆）描繪出。 3.12.8 以小量尺量取標準抗生素及樣品抑菌點中心到原點之高度求出 Rf值，加以記錄。當樣品抑菌點之 Rf值和新黴素標準液之 Rf值相同時，即可確認該種抗生素之殘留。 3.13 回收率試驗：分別添加 100 g/mL 新黴素標準溶液 500 及 1000 L 於檢體 10 g中，使添加濃度分別為 5 及 10 g/g，作三重複試驗。依第 3.9 節調製檢液，再以第 3.11 節分別測量其抑菌圈直徑。並以下列公式計算，求得檢體之回收率。 各添加濃度之檢體回收率（ %） A/B100 A：各添加濃度之檢液所產生之抑菌圈直徑平均值 B：各添加濃度之標準溶液所產生之抑菌圈直徑平均值 檢體平均回收率為 2 個添加濃度檢體回收率之平均值。 3.14 新黴素殘留量之計算：以新黴素標 準曲線之參比濃度修正點和參比濃度抑菌圈直徑平均值之差，修正新黴素參 比濃度之抑菌圈平均值並計算出檢體抑菌圈修正值，由標準曲線求得檢體殘 留新黴素濃度。再依下列公式計算，以求得該檢體之新黴素實際殘留量。 檢體中新黴素殘留量（ ppm） SR S：標準曲線上求得之檢體殘留新黴素濃度（ ppm） R：該類空白檢體添加新黴素試驗平均回收率（ %） 備考：本檢驗方法之最低檢出限量為 1 ppm。