1、August 2008DEUTSCHE NORM Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DINPreisgruppe 8nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e.V., Berlin, gestattet.ICS 67.050!$O.E“1441134www.din.deDDIN 10123Detection of salmonellae with immunoassaysAnalyse pour produits
2、 alimentaires Recherche de salmonella par un test immunoAlleinverkauf der Normen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 Berlinwww.beuth.deGesamtumfang 12 SeitenUntersuchung von Lebensmitteln DIN Deutsches Institut fr Normung e.V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, Nachweis von Salmonellen mitt
3、els ImmunoassaysAnalysis of foodstuffs DIN 10123:2008-08 2 Inhalt Seite Vorwort . 3 Einleitung 4 1 Anwendungsbereich 5 2 Normative Verweisungen. 5 3 Begriffe 5 4 Kurzbeschreibung 5 4.1 Allgemeines. 5 4.2 Voranreicherung in einem nicht selektiven, flssigen Nhrmedium 6 4.3 Anreicherung in selektiven,
4、flssigen Medien 6 4.4 Vorbereitung fr den ELISA. 6 4.5 Nachweis von Salmonellen 6 4.6 Besttigung und Identifizierung 6 5 Nhrmedien, Chemikalien und Seren .6 5.1 Allgemeines. 6 5.2 Nhrmedien und Chemikalien . 6 5.3 Seren 7 5.4 Reagenzien und Materialien fr den enzymgebundenen Immunoassay 7 6 Gerte un
5、d Glasgerte . 7 7 Probenahme 8 8 Probenvorbereitung 8 9 Durchfhrung (siehe Flieschema in Anhang A) . 8 9.1 Allgemeines. 8 9.2 Einwaage und Ausgangsverdnnung 8 9.3 Nicht selektive Voranreicherung. 8 9.4 Selektive Anreicherung 8 9.5 Nachweis von Salmonellen mittels enzymgebundenem Immunoassay. 8 9.6 A
6、uswertung des Enzymimmunoassays . 9 9.7 Isolierung und Besttigung . 9 10 Auswertung . 9 11 Untersuchungsbericht . 10 12 Qualittssicherung . 10 Anhang A (normativ) Flieschema der Untersuchung 11 Literaturhinweise . 12 DIN 10123:2008-08 3 Vorwort Diese Norm wurde vom Normenausschuss Lebensmittel und l
7、andwirtschaftliche Produkte (NAL) im Arbeits-ausschuss Mikrobiologische Lebensmitteluntersuchung einschlielich Schnellverfahren“ erarbeitet. DIN 10123:2008-08 4 Einleitung Wegen der groen Anzahl an frischen Proben, die aufgrund ihrer begrenzten Haltbarkeit ein Schnellverfahren erforderlich werden la
8、ssen, kann nun ein Immunoassay zum Nachweis von Salmonellen in Erwgung gezogen werden. Im Zusammenhang mit der ffentlichen Gesundheit hat der Wissenschaftliche Ausschuss fr Veterinrmanahmen der EU am 19./20. Juni 2002 eine Empfehlung abgegeben, nach der Mglichkeiten geschaffen werden sollen, schnell
9、ere und zur klassischen kulturellen Mikrobiologie alternative Verfahren zum Nachweis von Salmonellen anzuwenden. Insbesondere fr den Salmonellennachweis von fr Finnland und Schweden bestimmtes Fleisch sind diese Schnellanalyseverfahren bereits zugelassen worden 1. DIN 10123:2008-08 5 1 Anwendungsber
10、eich Diese Norm legt ein Routineverfahren zum Nachweis von Salmonellen mittels Immunoassays (z. B. ELISA, Immunochromatographie) und nachfolgender Besttigung fest. ANMERKUNG Es wird auf die Vorschriften des Infektionsschutzgesetzes hingewiesen. 2 Normative Verweisungen Die folgenden zitierten Dokume
11、nte sind fr die Anwendung dieses Dokuments erforderlich. Bei datierten Verweisungen gilt nur die in Bezug genommene Ausgabe. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe des in Bezug genommenen Dokuments (einschlielich aller nderungen). DIN EN ISO 6579:2007-10, Mikrobiologie von Lebensmittel
12、n und Futtermitteln Horizontales Verfahren zum Nachweis von Salmonella spp. (ISO 6579:2002+Amd 1:2007); Deutsche Fassung EN ISO 6579:2002+A1:2007 DIN EN ISO 7218, Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln Allgemeine Anforderungen und Leit-linien fr mikrobiologische Untersuchungen 3 Begriffe
13、Fr die Anwendung dieses Dokuments gelten die folgenden Begriffe. 3.1 Salmonellen Mikroorganismen, die durch Salmonella-spezifische Antikrper gebunden und durch eine enzymatische Farbreaktion oder durch an Antikrper gekoppelte farbige Beads erkannt werden und nach den in DIN EN ISO 6579 festgelegten
14、Verfahren besttigt werden 3.2 Nachweis von Salmonellen Feststellung der Anwesenheit oder Abwesenheit dieser Mikroorganismen in einer vorgegebenen Produkt-menge nach dem in dieser Norm vorgegeben Verfahren 4 Kurzbeschreibung 4.1 Allgemeines Der Nachweis von Salmonellen erfordert mehrere aufeinander f
15、olgende Schritte (siehe Anhang A). Bei der Verwendung von kommerziell erhltlichen immunologischen Nachweisverfahren (z. B. ELISA-Test-systeme oder immunochromatographische Tests), die mit dieser Norm vergleichbare Ergebnisse erzielen, ist der Nachweis von Salmonellen grundstzlich nach den Angaben de
16、s Herstellers zu fhren. Das hier beschrie-bene Verfahren ist beispielhaft fr einen ELISA. Salmonellen knnen im Probenmaterial in geringer Anzahl, sublethal geschdigt oder gemeinsam mit einer greren Anzahl anderer Mikroorganismen vorkommen. Daher sind eine Voranreicherung und eine selektive Anreicher
17、ung notwendig. DIN 10123:2008-08 6 4.2 Voranreicherung in einem nicht selektiven, flssigen Nhrmedium Die Probe wird mit der entsprechenden Menge gepufferten Peptonwassers oder einem anderen in DIN EN ISO 6579:2007-10, 9.1.2, aufgefhrten nicht selektiven Nhrmedium verdnnt und 18 h 2 h bei 37 C 1 C in
18、kubiert. 4.3 Anreicherung in selektiven, flssigen Medien Es erfolgt eine selektive Anreicherung in einem geeigneten selektiven Medien, zum Beispiel in Magnesium-chlorid-Malachitgrn haltigem Medium, Selenit-Cystin-Medium oder Tetrathionat. Das selektive Medium wird mit aus der Voranreicherung nach 4.
19、2 erhaltenen Kultur beimpft. 4.4 Vorbereitung fr den ELISA Die fr den ELISA bestimmte angereicherte Probe oder ein Aliquot der Probe wird, wenn erforderlich, vor der ELISA-Untersuchung mit Hitze inaktiviert. Ein anschlieender Khlvorgang ist vor der Applikation an den antikrpergebundenen Trger notwen
20、dig. 4.5 Nachweis von Salmonellen Die nach 4.3 oder 4.4 erhaltene Suspension wird auf einen Trger mit gebundenen Salmonella-Antikrpern gebracht. Durch eine Antigen-Antikrper-Reaktion werden vorhandene Salmonellen-Antigene an den Trger gebunden. Ein Waschschritt separiert gebundene von nicht gebunden
21、en Komponenten. Anschlieend wird ein enzymmarkierter Salmonellen-spezifischer Antikrper (Konjugat) an den Trger gebracht, um eine Bindung an die gekoppelten Salmonellen-Antigen-Antikrper-Komplexe zu vervollstndigen. Nach einem weiteren Separationsschritt wird die Menge der gebundenen enzymmarkierten
22、 Salmonellen-Antigene nach Zugabe eines Substrates anhand der enzymatischen Farbreaktion photometrisch gemessen. 4.6 Besttigung und Identifizierung Bei positivem Ausfall des Nachweises nach 4.5 wird ein Teil des Selektivmediums zur Besttigung herange-zogen. Die gelagerte Kultur wird auf zwei selekti
23、ve feste Nhrmedien ausgestrichen und die erhaltenen Kulturen werden biochemisch sowie serologisch besttigt. 5 Nhrmedien, Chemikalien und Seren 5.1 Allgemeines Zur blichen Laborpraxis siehe DIN EN ISO 7218. Bei der Verwendung von lichtempfindlichen Reagenzien muss die direkte Sonneneinstrahlung vermi
24、eden werden. 5.2 Nhrmedien und Chemikalien Es knnen alle Nhrmedien und Chemikalien nach DIN EN ISO 6579:2007-10, Anhang B, verwendet werden. Fr das Immunoassay wird nur ein selektives Anreicherungsmedium bentigt. Dabei wird jenes Medium gewhlt, welches von dem Hersteller des Immunoassays vorgegeben
25、ist oder blicherweise im Labor verwendet wird. DIN 10123:2008-08 7 5.3 Seren Nach DIN EN ISO 6579:2007-10, 5.3. 5.4 Reagenzien und Materialien fr den enzymgebundenen Immunoassay 5.4.1 Antikrpertrger1)Trger beschichtet mit spezifischen Salmonella-Antikrpern. ANMERKUNG Auf die berprfung der im Test na
26、chzuweisenden Salmonella spp. ist bereits unter 4.1 hingewiesen worden. 5.4.2 Waschpuffer Waschpuffer wird nach den Angaben des Herstellers mit Wasser verdnnt. 5.4.3 Konjugat Das Konjugat besteht aus einem mit einem Salmonella-spezifischen Antikrper kovalent gebundenem Enzym. Je nach Detektionssyste
27、m werden dafr geeignete Enzyme verwendet. Das Konjugat muss in genau definierten Konzentrationen vorliegen. 5.4.4 Substrat Das Substrat ist abhngig von dem im Konjugat verwendeten Enzym. 5.4.5 Stopreagens Das Stopreagens dient zur Beendigung der Enzym-Substrat-Reaktion. 5.4.6 Positiv-Kontrolle Salmo
28、nella-Antigen in geeignetem stabilen Puffer. 5.4.7 Negativ-Kontrolle Geeigneter Puffer ohne Antigen. 6 Gerte und Glasgerte bliche Ausstattung eines mikrobiologischen Labors, die Gerte nach DIN EN ISO 6579:2007-10, Abschnitt 6, und insbesondere die folgenden Gerte: 6.1 Beutelwalkmischer (Stomacher) o
29、der Labormischer 6.2 Laborzentrifuge, z. B. fr Zentrifugenglser, geeignet fr eine Zentrifugalbeschleunigung von 3 000 g 6.3 Wasserbad oder Inkubator, mit der erforderlichen Genauigkeit fr die nichtselektive und die selektive Anreicherung 1) Auskunft ber mgliche Bezugsquellen erteilt der Normenaussch
30、uss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DIN, Burggrafenstr. 6,10787 Berlin. DIN 10123:2008-08 8 6.4 Wasserbad, auf 100 C einstellbar 6.5 Photometer, Messung im Bereich vom Wellenlngenoptimum des Enzymkonjugates 6.6 Pipetten, Pipettenspitzen, Volumen 100 l bis 1 000 l 6.7 Horizonta
31、lschttler 7 Probenahme Nach DIN EN ISO 6579:2007-10, Abschnitt 7. 8 Probenvorbereitung Nach DIN EN ISO 6579:2007-10, Abschnitt 8. 9 Durchfhrung (siehe Flieschema in Anhang A) 9.1 Allgemeines Bei der Verwendung von kommerziellen Test-Kits ist darauf zu achten, dass der Test tatschlich alle Salmonella
32、 spp. nachweist. Ansonsten ist dem Untersuchungsbericht die Einschrnkung auf bestimmte Salmonellen beizufgen. 9.2 Einwaage und Ausgangsverdnnung Nach DIN EN ISO 6579:2007-10, 9.1. 9.3 Nicht selektive Voranreicherung Nach DIN EN ISO 6579:2007-10, 9.2. 9.4 Selektive Anreicherung Nach DIN EN ISO 6579:2
33、007-10, 9.3, mit folgender Abnderung: Die bentigten Selektivmedien werden nach den Vorgaben des ELISA-Test-Herstellers beimpft. Gleiches gilt fr die Bebrtungstemperatur und die Dauer der Bebrtung. Wenn eine Hitzeinaktivierung der Salmonellen vor der Zugabe an die trgergebundenen Antikrper erforderli
34、ch ist, wird nach der Bebrtung 1 ml des angereicherten Selektivmediums in ein Rhrchen gegeben und 15 min im Wasserbad bei 100 C erhitzt. Der Rest des Selektivmediums wird zur Besttigung positiver Ergebnisse bei 4 C 1 C aufbewahrt. Wenn eine Nachkultur erforderlich ist, wird diese nach den Angaben de
35、s Herstellers in definiertem Medium, in definierter Temperatur und in definierter Dauer durchgefhrt. 9.5 Nachweis von Salmonellen mittels enzymgebundenem Immunoassay Alle Reagenzien und Materialien mssen vor ihrem Gebrauch auf Raumtemperatur erwrmt worden sein. Reagenzien verschiedener Chargen drfen
36、 nicht vermischt werden. Alle Reagenzien und Lsungen mssen vor Gebrauch gut gemischt werden. DIN 10123:2008-08 9 Von der nach 9.4 gewonnenen, erhitzten und danach abgekhlten Kultur wird eine definierte Menge an die Salmonellen-spezifischen Antikrpertrger gegeben. Die Erstinkubation wird nach Angaben
37、 des Herstellers durchgefhrt. Nach diesem Schritt erfolgen Waschschritte, in denen der jeweilige Antikrpertrger von nicht gebundenen Komponenten (Antigen) getrennt wird. Anschlieend wird das Enzymkonjugat nach 5.4.3 auf die jeweiligen Antikrpertrger gegeben. Es wird eine von dem Hersteller definiert
38、e Inkubation durchgefhrt. Es werden erneute Waschschritte zur Entfernung des nicht gebundenen Enzymkonjugates durchgefhrt. Die vom Hersteller beschriebenen Waschsequenzen und Waschhufigkeiten mssen eingehalten werden. ANMERKUNG Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse des Enzymimmunoassays ist in stark
39、em Mae vom gleich-migen und ausreichenden Waschen der Kavitten abhngig. Anschlieend wird dem Antikrpertrger das Substrat nach 5.4.4 beigefgt. Das Substrat muss an das Enzym des Konjugates angepasst sein. Die folgende Farbreaktion wird nach einer vom Hersteller angegebenen Dauer ohne vorherige Waschs
40、chritte mittels Zugabe von Stopreagens abge-brochen. Die optische Farbintensitt des Ansatzes wird photometrisch bei der vom Hersteller vorgegebenen Wellenlnge gemessen. Die jeweilige Mengenangaben und Angaben zur Dauer der Inkubation durch den Hersteller mssen genauestens eingehalten werden. Mit jed
41、er Testdurchfhrung mssen Kontrollproben mitgefhrt werden. Dazu gehren mindestens eine Positiv-Kontrollprobe nach 5.4.6 und eine Negativ-Kontrollprobe nach 5.4.7. 9.6 Auswertung des Enzymimmunoassays Der Hersteller definiert einen Grenzwert, mit dem Salmonella-positive Proben deutlich zu erkennen sin
42、d. Der Test kann nur ausgewertet werden, wenn die vom Hersteller angegebenen Mindest- oder Maximalwerte fr die optische Dichte der Kontrollen mit den eigenen Werten bereinstimmen. ANMERKUNG Beispielhaft ist ein Prfwert (Optische Dichte), der als negativ angesehen wird, von kleiner 0,200. Das heit, d
43、ass es sich um eine Probe mit nicht nachweisbaren Salmonella-Antigenen handelt. Ein Prfwert von grer bzw. gleich 0,200 wird als positiv angesehen. Das heit, es wurden Salmonella-Antigene nachgewiesen. 9.7 Isolierung und Besttigung Zur Isolierung der Salmonellen aus der Probe wird die zuvor aufbewahr
44、te Selektiv-Kultur nach 9.4 verwendet. Die weitere Subkultivierung auf festen Nhrbden und die Besttigungsreaktionen erfolgen nach DIN EN ISO 6579:2007-10, 9.4 bis 9.5. 10 Auswertung Nach DIN EN ISO 6579:2007-10, Abschnitt 10. DIN 10123:2008-08 10 11 Untersuchungsbericht Nach DIN EN ISO 6579:2007-10,
45、 Abschnitt 11. Darber hinaus sind im Untersuchungsbericht mindestens anzugeben: a) der verwendete Immunoassay; b) wenn nicht allgemein Salmonella spp. erfasst wurden, die Salmonellen, die im Assay erfasst wurden; c) werden Abweichungen von den Angaben des Herstellers vorgenommen, mssen diese przisie
46、rt werden. 12 Qualittssicherung Nach DIN EN ISO 6579:2007-10, Abschnitt 12. DIN 10123:2008-08 11 Anhang A (normativ) Flieschema der Untersuchung DIN 10123:2008-08 12 Literaturhinweise 1 Verordnung vom 14. Oktober 2005 zur Durchfhrung der Verordnung (EG) Nr. 853/2004 des Europ-ischen Parlaments und d
47、es Rates hinsichtlich zustzlicher Garantien betreffend Salmonellen bei Sendungen bestimmten Fleischs und bestimmter Eier nach Finnland und Schweden Verordnung (EG) Nr. 1688/2005 DIN EN ISO 6887-1, Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln Vorbereitung von Untersuchungs-proben und Herstellung
48、 von Erstverdnnungen und von Dezimalverdnnungen fr mikrobiologische Untersuchungen Teil 1: Allgemeine Regeln fr die Herstellung von Erstverdnnungen und Dezimalver-dnnungen DIN EN ISO 6887-2, Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln Vorbereitung von Untersuchungs-proben und Herstellung von E
49、rstverdnnungen und von Dezimalverdnnungen fr mikrobiologische Untersuchungen Teil 2: Spezifische Regeln fr die Vorbereitung von Fleisch und Fleischerzeugnissen DIN EN ISO 6887-3, Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln Vorbereitung von Untersuchungs-proben und Herstellung von Erstverdnnungen und von Dezimalverdnnungen fr mikrobiologische Untersuchungen Te
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