1、Juli 2011DEUTSCHE NORM Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DINPreisgruppe 8DIN Deutsches Institut fr Normung e. V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e. V., Berlin, gestattet.ICS 67.100.01!$n8“
2、1759821www.din.deDDIN 10470Milch und Milcherzeugnisse Bestimmung des Molkenprotein- und Caseinanteils im Gesamtprotein Derivativspektroskopisches VerfahrenMilk and milk products Determination of whey protein content and casein content in total protein Derivative spectroscopic methodLait et produits
3、laitiers Dtermination de la teneur en protines du srum et de la teneur en casines dans lesprotines totales Mthode drivative spectroscopieAlleinverkauf der Normen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 BerlinErsatz frDIN 10470:1999-07www.beuth.deGesamtumfang 12 SeitenDIN 10470:2011-07 Inhalt Seite Vorwort 3
4、1 Anwendungsbereich .4 2 Normative Verweisungen4 3 Kurzbeschreibung .4 4 Chemikalien4 5 Gerte5 6 Probenahme .6 7 Durchfhrung.6 8 Auswertung 8 9 Untersuchungsbericht 10 Anhang A (informativ) Erluterungen .11 Literaturhinweise 12 2 DIN 10470:2011-07 Vorwort Dieses Dokument wurde vom Normenausschuss Le
5、bensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL), Arbeitsausschuss NA 057-05-13 AA Milch und Milchprodukte Probenahme- und Untersuchungsverfahren“ erarbeitet. Es wird auf die Mglichkeit hingewiesen, dass einige Texte dieses Dokuments Patentrechte berhren knnen. Das DIN ist nicht dafr verantwortlich
6、, einige oder alle diesbezglichen Patentrechte zu identifizieren. nderungen Gegenber DIN 10470:1999-07 wurden folgende nderungen vorgenommen: a) es wird nur noch die Messung und Auswertung der Derivativspektren mit 2. Ableitung beschrieben (siehe 7.3.2, Anmerkung 1); b) die Ergebnisse eines Ringvers
7、uches zur Verfahrensvalidierung sind aufgenommen worden; c) Anhang A (Herstellung von Referenzproben) und Anhang C (Gerteunabhngiger Auswertealgorithmus zur Berechnung der Derivativspektren) wurden gestrichen, die Auswertung wird in Abschnitt 8 beschrieben; d) das Spektrum in Bild 1 wurde aktualisie
8、rt; e) die Dauer der Verwendbarkeit der Proben- und Kalibrierlsungen wurde angegeben (siehe 7.1 und 7.4); f) die vom Spektralphotometer ausgegebenen und zur Berechnung eingesetzten Werte mssen in den Nachkommastellen mindestens drei signifikante Stellen aufweisen (siehe 7.3.2); g) der Korrelationsko
9、effizient der erhaltenen Kalibriergeraden muss mindestens 0,99 betragen; h) die Norm wurde technisch und redaktionell berarbeitet und ergnzt und damit an die derzeit gltigen Gestaltungsregeln angepasst. Frhere Ausgaben DIN 10470: 1999-07 3 DIN 10470:2011-07 1 Anwendungsbereich Diese Norm legt ein de
10、rivativspektroskopisches Verfahren zur Bestimmung des Casein- und Molken-proteinanteils im Gesamtprotein fest. Es ist fr Milch, Milchpulver und Speisequark anwendbar. 2 Normative Verweisungen Die folgenden zitierten Dokumente sind fr die Anwendung dieses Dokuments erforderlich. Bei datierten Verweis
11、ungen gilt nur die in Bezug genommene Ausgabe. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe des in Bezug genommenen Dokuments (einschlielich aller nderungen). DIN 10349, Bestimmung des pH-Wertes im Butterplasma DIN EN ISO 707, Milch und Milcherzeugnisse Leitfaden zur Probenahme 3 Kurzbeschre
12、ibung Um eine Exponierung der proteingebundenen aromatischen Aminosuren zu ermglichen und um eine homogene Umgebung fr die chromophoren Gruppen zu erreichen, werden die Proben mit 6 mol/l Guanidiniumchlorid gelst. Die Bestimmung des Molkenprotein- bzw. Caseinanteils im Gesamtprotein wird mit der UV-
13、Derivativ-spektroskopie durchgefhrt. Die quantitative Auswertung wird mit der zweiten Ableitung anhand der UV-Absorption der Aminosuren Tryptophan und Tyrosin vorgenommen, die charakteristische Maxima und Minima zwischen 270 nm und 300 nm im Derivativspektrum aufweisen. Die aus den Maxima bzw. Minim
14、a bei 283 nm, 287 nm, 290 nm und 294 nm der Derivativspektren berechnete Messgre (QD-Wert) ergibt eine lineare Korrelation zum Gehalt an Molkenprotein bzw. Casein im Gesamtprotein von Milch und Milchprodukten. Die Kalibrierung der Methode erfolgt mit Referenzproben, die ein bekanntes Casein/Molkenpr
15、otein-Verhltnis aufweisen. 4 Chemikalien 4.1 Allgemeines Es sind analysenreine Chemikalien zu verwenden. Das verwendete Wasser muss destilliert oder mindestens von entsprechender Reinheit sein. 4.2 GND-EDTA-Lsung, c(Guanidiniumchlorid GND) 6 mol/l; Ethylendiamin-tetraacetat c(Na2-EDTA 2 H2O) 0,01 mo
16、l/l 573 g Guanidiniumchlorid (CH6ClN3) und 3,72 g EDTA (Dinatriumsalz, C10H14N2Na2O8) werden in etwa 400 ml Wasser in einem 2-l-Becherglas gelst. Der Ansatz wird mit einem Magnetrhrer bei 50 C so lange gerhrt, bis das GND und EDTA vollstndig gelst sind. Die Lsung wird quantitativ in einen 1-l-Messko
17、lben bergefhrt und mit Wasser bis zur Marke aufgefllt. Danach wird die Lsung (pH 4,7) in ein 2-l-Becherglas gefllt und mit Natriumhydroxid-Lsung, c(NaOH) = 1 mol/l, auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt. Die erhaltene Lsung wird mittels Vakuumpumpe ber ein Membranfilter (5.4) filtriert. Die GND-EDTA
18、-Lsung ist eine Woche bei Raumtemperatur verwendbar. 4 DIN 10470:2011-07 Die Eignung des Guanidiniumchlorid-Prparats fr die Durchfhrung der UV-Derivativspektroskopie sollte durch eine Kontrollmessung berprft werden. Hierzu wird von der GND-EDTA-Lsung ein UV-Spektrum gegen Wasser im Bereich von 310 n
19、m bis 250 nm mit denselben Gerteeinstellungen wie zur Messung der Proben (siehe 7.2) aufgenommen. Im Normalspektrum drfen bis etwa 265 nm keine Peaks auftreten; das Derivativspektrum zeigt in diesem Bereich eine Linie, die weitgehend parallel zur Abszisse verluft. ANMERKUNG Das Guanidiniumchlorid-Pr
20、parat des folgenden Herstellers hat sich als geeignet erwiesen: Sigma Cat.No. G-4505, Roth Art. 0037.11). 4.3 Referenzproben Entsprechend dem gewnschten Messbereich mssen wenigstens drei pulverfrmige Referenzproben mit bekanntem Molkenprotein- bzw. Caseinanteil im Gesamtprotein zur Verfgung stehen,
21、die jeweils einen bekannten Molkenprotein- bzw. Caseinanteil im Gesamtprotein aufweisen. ANMERKUNG Folgende Referenzproben haben sich als geeignet erwiesen: NISECAS 15, 20, 25; NIZO food research B.V., NL-6718 Ede1). 5 Gerte bliche Laborausstattung und insbesondere Folgendes: 5.1 Zentrifuge, geeigne
22、t zum Entfetten von Milch bei einer wirksamen Zentrifugalbeschleunigung am ueren Ende der Gefe von etwa 3 000 g. 5.2 Ultraschallbad mit Schwingwanne, geeignet zur Aufnahme der Probengefe. 5.3 pH-Meter nach DIN 10349. 5.4 Membranfilter 0,2 m Porenweite, geeignet zur Filtration der GND-EDTA-Lsung (4.2
23、). 5.5 Membranfilter mit integriertem Glasfaser-Vorfilter, geeignet zur Filtration der Probenlsung (7.1). ANMERKUNG Ein Filter des folgenden Herstellers hat sich als geeignet erwiesen: Whatman, Schleicher NIZO food research B.V., NL-6718 Ede und Whatman, Schleicher die Messung erfolgt im Doppelstrah
24、lbetrieb gegen GND-EDTA-Lsung (4.2). Sofern einstellbar, sollte eine Spaltbreite von 1 nm oder 2 nm und eine Glttung von 0 nm gewhlt werden. Mit dem vom Spektralphotometer vorgegebenen Berechnungsverfahren wird die 2. Ableitung des Absorptionsspektrums berechnet. ANMERKUNG 1 Aufgrund bisheriger Ring
25、untersuchungen ergibt die 2. Ableitung in Kombination mit der in 8.1 angegebenen Berechnungsgleichung bei vielen UV-Spektralphotometern przisere Ergebnisse als die Anwendung der 4. Ableitung oder anderer Berechnungsgleichungen. 6 DIN 10470:2011-07 Die Anzahl der Datenpunkte zur Berechnung der Deriva
26、tivspektren muss auf einen Wert eingestellt werden, sodass sich ein glatter, runder Kurvenverlauf der Spektren ergibt (siehe Bild 1). Eine zu niedrige Anzahl an Datenpunkten fhrt zu einem kantigen Verlauf der Derivativspektren; eine zu hohe Anzahl an Datenpunkten verringert die Auflsung der Spektren
27、. Optimale Einstellungen mssen ggf. durch wiederholte Messungen derselben Probe mit unterschiedlichen Gerteeinstellungen in Vorversuchen ermittelt werden. Als optimal ist eine Einstellung des Spektralphotometers anzusehen, die bei einem runden Kurven-verlauf der Spektren die niedrigste Standardabwei
28、chung bei Mehrfachmessung ergibt. Die Gerte der verschiedenen Hersteller unterscheiden sich in ihrer Handhabung zur Messung und Berechnung der Derivativspektren. Deshalb sind die ber die Festlegungen dieser Norm hinausgehenden Anweisungen der Gertehersteller zu beachten. Legende X Wellenlnge in Nano
29、metern Y 2. Ableitung Bild 1 Derivativspektrum 2. Ableitung einer Milchpulver-Probe mit 17 % Molkenproteinanteil im Gesamtprotein Die Maxima bzw. Minima bei 283 nm, 287 nm, 290 nm und 294 nm des Derivativspektrums werden gemessen und als zweite Ableitung (2A/2) angegeben. Die vom UV-Spektralphotomet
30、er ausgegebenen und zur Berechnung (siehe 8.1) eingesetzten Werte mssen in den Nachkommastellen mindestens drei signifikante Stellen, d. h. Ziffern ohne fhrende Nullen, aufweisen. ANMERKUNG 2 DIN 1333 definiert die signifikanten Stellen als die erste von Null verschiedene Stelle bis zur Rundungsstel
31、le. Beispielsweise enthlt die Zahl 0,001 949 sechs Nachkommastellen und vier signifikante Stellen. Gertebedingt werden unterschiedliche Algorithmen zur Berechnung der Ableitung des Absorptionsspektrums angewendet, wodurch die Positionen der Maxima und Minima im UV-Derivativspektrum von den angegeben
32、en Nanometern abweichen knnen. In diesem Fall muss die tatschlich gemessene Position der Peaks ermittelt werden. Fr diese Position wird dann der entsprechende Wert abgelesen und zur Berechnung des QD2-Wertes eingesetzt (siehe 8.1). 7 DIN 10470:2011-07 7.4 Kalibrierung Es werden wenigstens drei Refer
33、enzproben (4.3) bentigt, die entsprechend dem gewnschten Mess-bereich jeweils einen bekannten Molkenprotein- bzw. Caseinanteil im Gesamtprotein enthalten. Zur Her-stellung der entsprechenden Messlsungen werden die Referenzproben in einem geeigneten Volumen GND-EDTA-Lsung (4.2) aufgenommen, wobei wie
34、 in 7.1 und 7.2 fr Milchpulver beschrieben verfahren wird. Die Lsungen der Referenzproben mssen tglich neu angesetzt werden. Die bekannten Anteile an Molkenprotein bzw. Casein im Gesamtprotein und die nach 8.1 ermittelten QD-Werte werden zur Berechnung einer linearen Regressionsgleichung eingesetzt,
35、 wobei jeweils der bekannte Anteil an Molkenprotein bzw. Casein im Gesamtprotein die abhngige Variable und der entsprechende QD-Wert die unabhngige Variable darstellt. Der Korrelationskoeffizient der erhaltenen Kalibriergeraden muss r 0,99 sein. Die Kalibrierproben werden im Verlauf einer Messreihe
36、tglich neu gemessen und zur Auswertung verwendet. 8 Auswertung 8.1 Berechnung Aus den nach 7.3.2 mit mindestens drei signifikanten Nachkommastellen ermittelten Messwerten wird der QD2-Wert (2. Ableitung) als Messgre zur Bestimmung des Molkenprotein- bzw. Caseinanteils im Gesamt-protein berechnet, wo
37、bei die folgende Gleichung (1) verwendet wird: 10021D2=ddQ (1) nm29022nm294221/ AAd = nm28322nm287222/ AAd =Dabei ist = zweite Ableitung bei der Wellenlnge 294 nmdes Normalspektrums; nm 29422/ A= zweite Ableitung bei der Wellenlnge 290 nmdes Normalspektrums; nm 29022/ A= zweite Ableitung bei der Wel
38、lenlnge 287 nmdes Normalspektrums; nm 28722/ A= zweite Ableitung bei der Wellenlnge 283 nmdes Normalspektrums. nm 28322/ ADer Molkenprotein- bzw. Caseinanteil am Gesamtprotein der Probe wird mit Hilfe der durch Kalibrierung (7.4) erhaltenen Regressionsgleichung berechnet, indem der ermittelte QD-Wer
39、t als unabhngige Variable in die Gleichung eingesetzt wird. ANMERKUNG Die Berechnungen (Kalibriergerade, QD-Wert, Molkenproteinanteil) lassen sich sehr schnell mit Hilfe einer Tabellenkalkulation durchfhren, wobei verschiedene Berechnungsgleichungen eingesetzt werden knnen. Eine entsprechende Micros
40、oftExcel-Datei kann angefordert werden bei: Max Rubner-Institut, Institut fr Sicherheit und Qualitt bei Milch und Fisch, Hermann-Weigmann-Str. 1, 24103 Kiel, Fax 0431/6092300. 8 DIN 10470:2011-07 8.2 Przision des Verfahrens 8.2.1 Allgemeines Die Przisionsdaten wurden in einem durch die Arbeitsgruppe
41、 Chemische und physikalische Untersuchungs-verfahren der Milch“ des Bundesamtes fr Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (BVL) zur Durchfhrung des 64 des Deutschen Lebensmittel- und Futtermittelgesetzbuchs (LFGB) durchgefhrten Ringversuch an einem Magermilchpulver, einem Speisequark (Magerstu
42、fe) sowie einem Speisequark (40 % Fett i. Tr.) ermittelt. 8.2.2 Wiederholgrenze r Die Differenz zwischen zwei an identischem Untersuchungsmaterial durch einen einzigen Bearbeiter mit der- selben Gerteausstattung innerhalb der krzestmglichen Zeitspanne gefundenen Ermittlungsergebnissen wird bei blich
43、er und korrekter Anwendung des Verfahrens die in Tabelle 1 angegebene Wiederholgrenze (r) im Mittel nicht hufiger als einmal in 20 Fllen berschreiten. 8.2.3 Vergleichgrenze R Durch zwei Labors mitgeteilte Ermittlungsergebnisse an identischem Untersuchungsmaterial werden sich bei blicher und korrekte
44、r Anwendung des Verfahrens im Mittel nicht hufiger als einmal in 20 Fllen um mehr als die in Tabelle 1 angegebene Vergleichgrenze (R) unterscheiden. Tabelle 1 Statistische Kenngren fr Magermilchpulver, Speisequark (Magerstufe) und Speisequark 40 % Fett i. Tr. Merkmal Magermilch-pulver Speisequark (M
45、agerstufe) Speisequark 40 % Fett i. Tr. Anzahl teilnehmender Laboratorien 13 13 13 Anzahl Laboratorien nach Eliminierung der Ausreier 11 11 11 Anzahl Ausreierlaboratorien 2 2 2 Mittelwert, % 16,97 0,58 15,44 0,28 14,24 0,50 Vergleichstandardabweichung, sR, % 1,02 0,75 1,08 Relative Vergleichstandard
46、abweichung, sR, % 6,00 4,85 7,61 Vergleichgrenze R (2,8 sR), % 2,85 2,10 3,03 Relative Vergleichgrenze R (2,8 sR), % 16,79 13,60 21,28 Wiederholstandardabweichung sr, % 0,37 0,65 0,79 Relative Wiederholstandardabweichung sr, % 2,16 4,19 5,52 Wiederholgrenze r (2,8 sr), % 1,02 1,81 2,20 Relative Wied
47、erholgrenze r (2,8 sr), % 6,01 11,72 15,45 9 DIN 10470:2011-07 9 Untersuchungsbericht Im Untersuchungsbericht sind mindestens anzugeben: a) angewendetes Untersuchungsverfahren unter Verweisung auf diese Norm; b) Art der Probe; c) Art und Datum der Probenahme; d) Caseinanteil im Gesamtprotein der Pro
48、be, angegeben als Massenanteil in %; e) Molkenproteinanteil im Gesamtprotein der Probe, angegeben als Massenanteil in %; f) Untersuchungsdatum; g) Begrndung, falls von dieser Norm abgewichen worden ist. 10 DIN 10470:2011-07 Anhang A (informativ) Erluterungen Die Anwendbarkeit des Verfahrens wurde bi
49、sher an zahlreichen, verschiedenen Milchprodukten berprft. Die Filtration der Proben ber Membranfilter mit integriertem Glasfaser-Vorfilter fhrt auer bei Speisequark zu einer besseren Przision der Messwerte (Vermeidung von Streulichteffekten). Das Verfahren wurde auch bei Proben angewendet, die enzymatisch hydrolysierte Milchproteine enthalten. Die U
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