1、DIN1 DIN LO472 %b 27?!+4;! 05hTlQ7 A27 U Bestimmung des Molkenprotein- und Caseinanteils am Gesamtprotein von Milch und Milchprodukten Elektrophoretisches Verfahren DEUTSCHE NORM Juni 1996 - DIN - 10472 I Normenausschu Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DIN Deutsches Institut fr
2、Normung e.V ICs 67.100.10 Deskriptoren: Milch, Milchprodukt, Casein, Mol kenprotein, elektrophoretisches Verfahren Determination of casein and whey protein contents of milk and milk products - Electrophoretic method Dtermination de la teneur en casines et en protines du srum dans le lait et les prod
3、uits laitiers - Methode electrophoretique Vorwort Diese Norm wurde vom Normenausschu Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte, Arbeitsausschu “Chemi- sche und physikalische Milchuntersuchung”, erarbeitet. Anhang A und Anhang B sind informativ. Die mit diesem elektrophoretischen Verfahren erhalt
4、enen Ergebnisse sind mit den nach DIN 10464 (Casein-Phosphor- Verfahren) oder DIN 10466 (Polarographisches Verfahren) ermittelten Ergebnissen vergleichbar. 1 Anwendungsbereich 3.1 Caseinanteil am Gesamtprotein Diese Norm legt ein elektrophoretisches Verfahren zur Bestimmung des Casein- und Molkenpro
5、teinanteils am Gesamtprotein fest. Es ist fr Milch, Speisequark, Milchpulver, Casein und Caseinat anwendbar. 3.2 Molkenproteinanteil am Gesamtprotein Der Caseinanteil am Gesamtprotein von Milch bzw. Milch- Produkten ist der mit dem elektrophoretischen Verfahren bestimmte Massenanteil an Substanzen,
6、angegeben in %. 2 Normative Verweisungen Diese Norm enthlt durch datierte oder undatierte Verwei- sungen Festlegungen aus anderen Publikationen. Diese normativen Verweisungen sind an den jeweiligen Stellen im Text zitiert, und die Publikationen sind nachstehend aufgefhrt. Bei dati,erten Verweisungen
7、 gehren sptere Anderungen oder Uberarbeitungen dieser Publikationen nur zu dieser Norm, falls sie durch nderung oder Uberar- beitung eingearbeitet sind. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe der in Bezug genommenen Publi- kation. DIN 10327 DIN IS0 5725 Milch und Milchprodukte - Proben
8、ahmetechnik Przision von Meverfahren - Ermittlung der Wieder- hol- und Vergleichprzision von festgelegten Mever- fahren durch Ringversuche; Identisch mit IS0 5725 : 1986 3 Definitionen Fr die Anwendung dieser Norm gelten folgende Defini- tionen: Der Molkenproteinanteil am Gesamtprotein von Milch bzw
9、. Milchprodukten ist der mit dem elektrophoretischen Ver- fahren bestimmte Massenanteil an Substanzen, angege- ben in%. 4 Kurzbeschreibung des Verfahrens Die Bestimmung des Molkenprotein- bzw. Caseinanteils am Gesamtprotein erfolgt mit einer Natriumdodecylsul- fat(SDS)-Polyacrylamidgel-Elektrophores
10、e. Die Probe wird mit SDS-Lsung und Dithiothreitol-Lsung versetzt und in kochendem Wasser inkubiert. Dabei entstehen SDS-Protein-Komplexe, die sich im elektrischen Feld wie Anionen verhalten. Die Elektrophorese in einem Polyacryl- amidgel mit geringer Porengre fhrt zu einem Moleku- larsiebeffekt, wo
11、bei die Proteine entsprechend der unter- schiedlichen Moleklgre voneinander getrennt werden. Aufgrund ihrer geringeren Moleklgre wandern die Molkenproteine schneller als die Caseine. Durch Verwen- dung von Porengradientengelen werden nach Anfrbung des Elektropherogramms scharf voneinander abge- gren
12、zte Proteinbanden erhalten. Diese Proteinbanden werden durch densitometrische Messung quantitativ aus- gewertet, wobei sich der Molkenproteinanteil aus den Peakflchen der PLactoglobulin- und a-Lactalbumin- Bande im Verhltnis zu den Peakflchen von a-, p und x-Casein ergibt. Fortsetzung Seite 2 bis 7
13、I 0 DIN Deutsches Institut fr Normung e.V. . Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, Ref. NL DIN 10472 : 1996-06 Preisgr: 08 Vertr-Nr: O008 nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e.V, Berlin, gestattet. Alleinverkauf der Normen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 Berlin Seite
14、2 DIN 10472 : 1996-06 5 Chemikalien Es sind analysenreine Chemikalien zu verwenden. Das verwendete Wasser mu destilliert oder mindestens von entsprechender Reinheit sein. ANMERKUNG: Bei Verwendung von geeigneten, im Handel erhltlichen, gebrauchsfertigen Geltrgerfolien) mit Probeaufnahmekammern sowie
15、 gebrauchsfertigen Pufferstreifen fr die Anode und die Kathode werden die unter 5.1, 5.2 und 5.4 bis 5.6 aufgefhrten Chemikalien bzw. Lsungen nicht bentigt. 5.1 Dichlordimethylsilan-Lsung 2 %ige Lsung in 1,lJ -Trichlorethan (C2H3C13) 5.2 Polyacrylamidgele Achtung: Acrylamide sind als Monomere neurot
16、oxisch. Einatmen, Verschlucken und Berhrung mit der Haut mu vermie- den werden. Die Aufnahme erfolgt auch durch unverletzte Haut, so da unbedingt Einmalhandschuhe zu tragen sind. Deshalb sollten anstelle der Einwaagen der Acrylam.Me kommerziell erhltliche Acrylamid-Fertiglsungen ver- wendet werden.
17、Lsungen mit Massenanteilen von 30 % Acrylamiden (Massenverhltnis 97 % Acrylamid und 3 % N,N-Methylen-bis-acrylamid(B1S) sind geeignet. Reste von Acrylamiden sind mit einem berschu von Ammoniumperoxidisulfat (siehe 5.5) zum Auspolymerisie- ren versetzt. 5.2.1 Gelstammlsung 29,l g Acrylamid (C3H,NO) u
18、nd 0,9 g N,N-Methylenbis- acrylamid werden in einem 100-ml-Becherglas in etwa 80 ml Wasser unter Rhren (Magnetrhrer, siehe 6.8) gelst. Die Lsung wird in einen 100-ml-Mekolben ber- gefhrt, bis zur Marke aufgefllt und nach dem Mischen ber ein Faltenfilter filtriert. 5.2.2 Trenngei-Pufferlsung 9,8 g Tr
19、is(hydroxymethyl)aminomethan (C,H,NO,), 0,215 g Natriumdodecylsulfat (C12H25Na04S) und 5 mg Natriumazid (NaN3) werden in einem 100-ml-Becherglas in etwa 40 ml Wasser unter Rhren (Magnetrhrer) gelst und der pH-Wert mit verdnnter Salzsure c (HCI) = 4 molil auf pH = 8,8 eingestellt. Anschlieend wird di
20、e Lsung in einen 50-ml-Mekolben bergefhrt und mit Wasser aufgefllt. 5.2.3 Glycerin-Wasser-Mischung 60 g Glycerin (C3H803) werden mit 40 ml Wasser ver- mischt. 5.2.4 Schwere Geiisung, Gelkonzentration In ein 50-ml-Becherglas werden nacheinander 2,O ml Gelstammlsung (siehe 5.2.1 ), 3,5 ml Trenngel-Puf
21、fer- Isung (siehe 5.2.2), 6 ml Glycerin-Wasser-Mischung (siehe 5.2.3) und 3,5 ml Wasser pipettiert und anschlie- end miteinander vermischt. (Massenanteil der Acrylamide) = 4% 5.2.5 Leichte Gelisung, Geikonzentration In ein 50-mi-Becherglas werden nacheinander 9,2 ml Gelstammlsung (siehe 5.2.1) und 2
22、,8 ml Trenngel-Puffer- Isung (siehe 5.2.2) pipettiert und miteinander vermischt. (Massenanteil der Acrylamide) = 23% 5.3 Proben-Pufferlsung In einem 25-ml-Becherglas werden zu 0,6 g SDS und 20 mg Dithiothreitol (DTT) (C4HI0O2S2) etwa 15 ml Was- ser und genau 0,5 ml Trenngel-Pufferlsung (siehe 5.2.2)
23、 zugegeben und unter Rhren (Magnetrhrer) gelst. Die Lsung wird in einen 20-ml-Mekolben bergefhrt und bis zur Marke mit Wasser aufgefllt. Anschlieend werden etwa 2 mg Bromphenolblau (CISH,Br40,S) zur Sichtbarmachung der Front whrend der Elektrophorese zugegeben. Die Pufferlsung ist bei Bedarf frisch
24、herzustellen. 5.4 N,N,N,N-Tetramethylendiamin 5 g TEMED werden in 20 ml Wasser gelst. Achtung: TEMED reizt die Augen, Atemorgane und die Haut. (TEMED)-Lsung 5.5 Ammoniumperoxidsulfat (APS)-Lsung 80 mg APS (NH4)2S208 werden in 1 ml Wasser gelst. Die Lsung ist bei Bedarf frisch herzustellen. 5.6 Elekt
25、roden-Pufferlsung (Gebrauchslsung) In einem 1-1-Becherglas werden 144 g Glycin (C2H5NO2), 10 g SDS und 0,l g Natriumazid in etwa 900 ml Wasser unter Rhren (Magnetrhrer etwa 1 h) gelst. Anschlie- end wird der pH-Wert durch portionsweise Zugabe von etwa 30 g Tris(hydroxymethyl)aminomethan auf pH = 8,3
26、 eingestellt (etwa 2 h, bis ein konstanter pH-Wert erreicht wird). Danach wird die Lsung in einen l-l-Mekolben bergefhrt und bis zur Marke aufgefllt. 1 Volumenanteil dieser Stammlsung wird mit 9 Volumenanteilen Wasser zur Herstellung der Gebrauchslsung verdnnt. 5.7 Kerosin fr Khlzwecke 5.8 Fixierlsu
27、ng 100 ml Essigsure w (C2H402) = (Eisessig), 400 ml Ethanol w (CH,O) = 96%2) und 500 ml Wasser werden miteinander vermischt. 5.9 Frbelsung 0,25 g Coomassie Brilliant Blau R 250 (C.i.42655)3) werden in 250 ml Entfrbelsung (siehe 5.10) gelst. Die Frbelsung wird anschlieend durch einen Faltenfilter (mi
28、ttlere Filtrationsgeschwindigkeit) filtriert. ) ber Bezugsquellen gibt Auskunft: DIN-Bezugsquellen fr normgerechte Erzeugnisse im DIN Deutsches Institut fr. Normung e.V, Burggrafenstr. 6, 10787 Berlin, Postanschrift 10772 Berlin *) Massenanteil 3, Colour Index, The Society of Dryers and Colorists, B
29、radford (England) and The American Association of textile Chemists and Colorists, North Carolina (USA), 1971 i BIN1 DIN LO472 .b in das vordere freie Ende des Schlauches wird eine Kunststoffspitze (hergestellt durch Abschneiden des vorderen Drittels einer gelben Pipetten- spitze, passend fr 1 00-yi-
30、Kolbenhubpipetten) gesteckt. 6.8 Magnetrhrer 6.9 Hhenverstellbare Laborplattform, etwa 140 mm x120 mm 6.10 Verstellbare Kolbenhubpipette zum Abmessen von Volumina zwischen 1 O pl und 1 O0 pi 6.1 1 Mikroliterspritze oder verstellbare Kolbenhub- pipette zum Abmessen von 3 pl ) Siehe Seite 2 *) Siehe S
31、eite 2 Seite 3 DIN 10472 : 1996-06 6.1 2 Elektrodenbrcken Chromatographiepapier, sehr schnell saugend, mit einem Flchengewicht von 320 gim2 Dicke: 0,9 mm; zurechtgeschnitten auf die Mae von etwa 25 cm x etwa 12 cm. 6.1 3 schalen), Mae etwa 300 mm x 150 mm. Frbe- und Entfrbeschalen (z. B. Instrumente
32、n- 6.1 4 pH-Meter 6.1 5 Kryostat, einstellbar auf 15C f. 1 OC. 6.16 30 mA, 30 W. Stromversorgungsgert, einstellbar auf 600 V, 6.17 Geschlossene Horizontal-Elektrophoresekam- mer mit Khlblock zur Aufnahme von Geltrgerfolien nach 6.6. WARNHINWEIS: Beim ffnen des Kammerdeckels mu eine Unterbre- chung d
33、es Stromkreises sichergestellt sein. 6.18 Densitometer zur Transmissions-Messung der gefrbten Proteinbanden mit einer computergesttzten Auswertung (automatisch und manuell) der gemessenen Peakflchenwerte. 6.19 Skalpell 7 Probenahme Nach DIN 10327 8 Durchfhrung ANMERKUNG: Bei Verwendung von geeignete
34、n, im Handel erhltlichen, gebrauchsfertigen Gel- trgerfolien mit dazugehrigen Pufferstreifen (siehe Anmerkung zu 5) sind die Arbeitsschritte 8.2 bis 8.4 nicht erforderlich. 8.1 Herstellung der Probenlsung Der Proteinanteil der Probenlsung sollte 3 mg Protein/rni bis 5 mg Protein/ml betragen. Etwa 40
35、 mg Speisequark bzw. 12 rng Milchpulver bzw. 5 mg Casein bzw. Caseinat werden in ein Zentrifugenge- f nach 6.1 eingewogen, mit 1 ml Proben-Pufferlsung (siehe 5.3) versetzt und grndlich durchmischt. Bei der Untersuchung von Milch werden 100 pl Probe mit 900 pi Proben-Pufferlsung versetzt. Die in der
36、Proben-Pufferl- sung aufgenommene Probe wird 3 min im kochenden Wasserbad erhitzt. Vor der Entnahme zur Elektrophorese werden eventuell vorhandene unlsliche Bestandteile durch Zentrifugation (siehe 6.2) abgetrennt. ANMERKUNG: Zur Kontrolle der elektrophoreti- schen Trennbedingungen bzw. Bandenzuordn
37、ung kann eine rnilchproteinhaltige Kontrollprobe rnitge- fhrt werden. Als Kontrollprobe eignet sich z. B. ein Magermilchpulver, das ber eine lngere Zeit- spanne bei -2OOC ohne elektrophoretisch me- bare Vernderungen gelagert werden kann. DINL DIN Loir72 96 E 2794irY2 0563330 331 W I Seite 4 DIN 1047
38、2 : 1996-06 8.2 Vorbereitung der Giekassetten Die Glasplatten der Giekassette (siehe 6.3) mssen vor der ersten Verwendung gereinigt und mit Aceton entfettet werden. Zur Herstellung der Gieschablone fr das Porengradientengel werden die Probenaufnahmekam- mern als Negativform auf die mit dem U-frmigen
39、 Abctandshalter versehene Deckglasplatte der Giekas- cette (siehe 6.3) aufgeklebt. Hierzu werden so viele Lagen von transparenter Klebefolie (siehe 6.4) parallel zur Lngskante und etwa 1 cm oberhalb des Abstandshalters bereinandergeklebt, bis die gewnschte Probenkam- mertiefe von etwa 0,2 mm erreich
40、t ist. Danach werden ins- gesamt 24 rechteckige Probekammern mit den Maen von 7 mm x 2 mm rnit einem scharfen Skalpell ausge- schnitten; der Abstand zwischen den Probekammern betrgt etwa 3 mm. Nach dem Andrcken der Schneide- kanten werden Klebstoffreste mit einem in Ethanol getrnkten Papiertuch entf
41、ernt. Zur Hydrophobisierung der Gieschablone werden einige mi der Dichlordimethyl- Silan-Lsung (siehe 5.1) ber die gesamte Glasplatte und Deckglasplatte einschlielich Probenaufnahmekammern mit einem Papiertuch verteilt. Sobald das Lsemittel ver- dampft ist, wird die Gieschablone mit Wasser abgewa- s
42、chen. Die Silan-Beschichtung mu nur einmal vor dem ersten Gebrauch durchgefhrt werden. ANMERKUNG: Ausfhrliche Anleitungen zur Herstellung von Gieschablonen fr die Polyacryl- amidgel-Elektrophorese sind von den Herstellern der Giekassetten erhltlich. 8.3 Zusammenbau der Giekassette Fr den Zusammenbau
43、 der Giekassette (siehe 6.3) wird zunchst die Geltrgerfolie (siehe 6.6) mit der hydropho- ben Seite auf die mit ein paar Tropfen Wasser benetzte Glasplatte mit einer Handgummirolle aufgewalzt (hydro- phile Seite nach oben!); die Geltrgerfolie It man an der oberen Lngenkante der Glasplatte etwa 1 mm
44、ber- stehen. Danach wird die Deckglasplatte rnit den Proben- aufnahmekammern nach unten auf die aufgewalzte Geltrgerfolie gelegt und die Giekassette zusammenge- klammert. Vor dem Gieen des Gradienten-Trenngels (siehe 8.4) wird die Giekassette etwa 10 min im Khl- schrank bei etwa 4OC gekhlt. 8.4 Giee
45、n des Gradienten-Trenngels Zum Gieen des Gradienten-Trenngels wird der Gradien- tenmischer (siehe 6.7) auf dem Magnetrhrer (siehe 6.8) so angeordnet, da sich das Auslaufniveau des Gradien- tenmischers etwa 10 cm oberhalb der Oberkante der Giekassette befindet. Vor dem Befllen des Gradienten- mischer
46、s mu das Ventil zwischen den Kammern sowie die Schlauchklemme geschlossen sein. In die vordere rnit dem Auslarohr versehene Kammer des Gradientenmi- Schers wird ein Magnetrhrstab gelegt und in die hintere Kammer wird zum Volumenausgleich der Kompensa- tionsstab gestellt. 6 mi der leichten Gellsung (
47、siehe 5.2.5) werden in die hintere Kammer pipettiert. Der Verbindungskanal zwi- schen den Kammern wird durch sehr rasches ffnen und Schlieen des Ventils gefllt. Falls hierbei die leichte Gel- Isung in die vordere Kammer geflossen ist, pipettiert man diese in die hintere Kammer zurck. Danach werden 9
48、 mi der schweren Gellsung (siehe 5.2.4) in die vordere Kam- mer pipettiert. Erst jetzt wird die bei etwa 4OC im Khlschrank gekhlte Giekassette (siehe 8.3) auf den Arbeitsplatz gestellt. Das mit der Pipettenspitze versehene Schlauchende am Aus- laufrohr der vorderen Kammer des Gradientenmischers wird
49、 in die Mitte der senkrecht aufgestellten Giekassette aufgesetzt, so da die Oberkante der Kassette zum leich- teren Befllen aufgespreizt wird. Anschlieend werden von der TEMED-Lsung (siehe 5.4) 15 pi in die hintere Kammer und 25 pl in die vordere Kam- mer pipettiert und mit dem Kompensationsstab bzw. Magnetrhrstbchen verteilt. Danach werden von der
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