1、Mrz 2011DEUTSCHE NORM Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DINPreisgruppe 8DIN Deutsches Institut fr Normung e. V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e. V., Berlin, gestattet.ICS 67.140.20!$l1“1
2、739914www.din.deDDIN 10779Untersuchung von Kaffee und Kaffee-Erzeugnissen Bestimmung des Gehaltes an 16-O-Methylcafestol in Rstkaffee HPLC-VerfahrenAnalysis of coffee and coffee products Determination of 16-O-methyl cafestol content of roasted coffee HPLC-methodAnalyse du caf et des drivs Dterminati
3、on de la teneur en 16-O-mthyle cafestole du caf torrfi Mthode par HPLCAlleinverkauf der Normen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 BerlinErsatz frDIN 10779:1999-02www.beuth.deGesamtumfang 12 SeitenDIN 10779:2011-03 Inhalt Seite Vorwort . 3 1 Anwendungsbereich 4 2 Normative Verweisungen. 4 3 Begriffe 4 4
4、Prinzip 4 5 Chemikalien und Lsungen. 4 6 Gerte. 5 7 Probenahme 6 8 Durchfhrung 6 8.1 Probenvorbereitung 6 8.2 Isolierung des Unverseifbaren 7 9 Auswertung . 8 9.1 Allgemeines. 8 9.2 Berechnung. 8 10 Przision des Verfahrens. 8 10.1 Allgemeines. 8 10.2 Wiederholprzision. 9 10.3 Vergleichprzision 9 11
5、Untersuchungsbericht . 9 Anhang A (normativ) Ergebnisse des Ringversuchs . 10 Anhang B (informativ) Beispiel fr ein Chromatogramm. 11 Literaturhinweise . 12 2 DIN 10779:2011-03 Vorwort Diese Norm wurde vom Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte, Arbeitsausschuss NA 057-05-09 A
6、A Kaffee“ erarbeitet. Seit der ersten Ausgabe 1999 wurde deutlich, dass die in Anhang A wiedergegebene Tabelle miss-verstndlich ist. Daher wurde die Umformulierung des Anhanges fr notwendig erachtet. Es wird auf die Mglichkeit hingewiesen, dass einige Elemente dieses Dokuments Patentrechte berhren k
7、nnen. Das DIN und/oder die DKE sind nicht dafr verantwortlich, einige oder alle diesbezglichen Patentrechte zu identifizieren. nderungen Gegenber DIN 10779:1999-02 wurden folgende nderungen vorgenommen: a) der veraltete Ausdruck Lsungsmittel“ wurde durch Lsemittel“ ersetzt; b) der veraltete Ausdruck
8、 Hochleistungsflssigkeitschromatographie“ wurde durch Hochleistungsflssig-chromatographie“ ersetzt; c) in 16-O-Methylcafestol“ wurde das O“ kursiv gesetzt; d) die Verfahrensanweisung wurde eingngiger formuliert; e) der Abschnitt 7 Probenahme“ wurde neu formuliert; f) der Anhang A mit den Ergebnissen
9、 des Ringversuchs wurde umformuliert. Frhere Ausgaben DIN 10779: 1999-02 3 DIN 10779:2011-03 1 Anwendungsbereich Diese Norm legt ein HPLC-Verfahren zur Bestimmung des Gehaltes an 16-O-Methylcafestol in Rstkaffee fest. Das Verfahren ist erprobt fr einen Massenanteil von 50 mg bis 300 mg 16-O-Methylca
10、festol je kg Rstkaffee. 2 Normative Verweisungen Die folgenden zitierten Dokumente sind fr die Anwendung dieses Dokuments erforderlich. Bei datierten Verweisungen gilt nur die in Bezug genommene Ausgabe. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe des in Bezug genommenen Dokuments (einschli
11、elich aller nderungen). DIN ISO 3310-1, Analysensiebe Technische Anforderungen und Prfung Teil 1: Analysensiebe mit Metalldrahtgewebe DIN ISO 3696, Wasser fr analytische Zwecke Anforderungen und Prfungen 3 Begriffe Fr die Anwendung dieses Dokuments gilt der folgende Begriff. 3.1 Gehalt an 16-O-Methy
12、lcafestol der nach dem hier festgelegten Verfahren bestimmte Gehalt an 16-O-Methylcafestol in Rstkaffee, angegeben als Massenanteil in mg je kg Rstkaffee 4 Prinzip Die gemahlene Probe wird einer Fettextraktion mit tert.-Butylmethylether (tBME) unterzogen. Nach beendeter Extraktion werden die Kaffeel
13、ipide mit ethanolischer Kaliumhydroxid-Lsung unter Rckfluss verseift, und anschlieend wird das Unverseifbare durch Ausschtteln mit tBME isoliert. Nach dem Abdestillieren des Lsemittels wird der Rckstand in einer definierten Menge Dichlormethan aufgenommen. Ein Aliquot wird zur Trockene gebracht, mit
14、 der vorgegebenen Menge HPLC-Eluens aufgenom-men und hochleistungsflssigchromatographisch untersucht. Detektiert wird bei einer Wellenlnge von 220 nm. Die Identifizierung erfolgt durch Vergleich der jeweiligen Retentionszeit mit der der betreffenden Standardsubstanz. Die Quantifizierung wird dann na
15、ch dem Verfahren des externen Standards ber die Peakflchen vorgenommen. 5 Chemikalien und Lsungen Soweit nicht anders angegeben, sind analysenreine Chemikalien zu verwenden. Das verwendete Wasser muss Qualitt 1 nach DIN ISO 3696 entsprechen. 5.1 tert.-Butylmethylether (tBME), geeignet fr HPLC. 5.2 A
16、cetonitril, geeignet fr HPLC. 5.3 Methanol, 96 %, reinst. 5.4 Dichlormethan, geeignet zur Analyse. 5.5 Natrium-L(+)-ascorbat 4 DIN 10779:2011-03 5.6 Natriumchlorid, zur Analyse. 5.7 Natriumsulfat, wasserfrei, reinst, Lebensmittelqualitt. 5.8 Siedesteine 5.9 Kaliumhydroxid, Pltzchen zur Analyse. 5.10
17、 Ethanolische Kaliumhydroxidlsung, 100 g Kaliumhydroxid werden in 100 ml Wasser gelst und mit Ethanol auf 1000 ml aufgefllt. 5.11 Natriumsulfat, wasserfrei, Natriumsulfat wird bei 550 C 12 h geglht, nach dem Abkhlen im Exsik-kator im Mrser zerrieben und in einem Iodzahlkolben im Exsikkator aufbewahr
18、t. 5.12 Fliemittel, 60 Volumenteile Acetonitril und 40 Volumenteile Wasser werden miteinander gemischt. 5.13 16-O-Methylcafestol-Standardlsungen 5.13.1 Stammlsung Etwa 10 mg 16-O-Methylcafestol werden in einen 100-ml-Messkolben eingewogen (etwa 100 g/ml). Die Substanz wird im Fliemittel nach 5.12 ge
19、lst (Ultraschallbad), und anschlieend wird der Kolben bis zur Marke aufgefllt. 5.13.2 Verdnnung Aus der Stammlsung wird eine Verdnnung hergestellt, deren Gehalt an 16-0-Methylcafestol im Bereich der Messlsung liegt. 5.13.3 Stabilitt 5.13.3.1 Stammlsung Die Stammlsung ist bei Khlschranklagerung ber e
20、ine Zeitspanne von mindestens 12 Wochen stabil. 5.13.3.2 Verdnnungen Verdnnte Standardlsungen (Konzentrationen etwa 10 g/ml und 50 g/ml) sind bei Aufbewahrung im Khlschrank, aber auch bei Lagerung bei Raumtemperatur (20 C, keine direkte Sonneneinstrahlung) mindestens 3 Wochen stabil. 5.13.3.3 Proben
21、lsung Die Probenlsung ist bei Raumtemperatur ohne Lichtschutz etwa 26 Tage stabil. Starke Einstrahlung von Sonnen- oder UV-Licht ist jedoch zu vermeiden. 6 Gerte bliches Laboratoriumsgert und insbesondere die in 6.1 bis 6.18 angegebenen Gerte. 6.1 Kaffeemhle, geeignet zum Mahlen von Rstkaffee-Bohnen
22、 oder eine geeignete Universalmhle 6.2 Siebe mit Drahtsiebbden der Maschenweiten 0,63 mm und 0,25 mm, die die Anforderungen nach DIN ISO 3310-1 erfllen. 6.3 Mrser und Pistill 5 DIN 10779:2011-03 6.4 Extraktionshlsen 6.5 Soxhlet-Extraktionsapparatur 6.6 250-ml-Rundkolben 6.7 Vakuumrotationsverdampfer
23、 6.8 Ultraschallbad 6.9 Heizquelle 6.10 Khler 6.11 500-ml-Scheidetrichter 6.12 Faltenfilter, Durchmesser 150 mm 6.13 4-ml-Glasvials, Klarglas oder Braunglas 6.14 Heizbare Vorrichtung zum Abblasen von Lsemitteln1)6.15 Membranfilter, 0,2 m 6.16 Hochleistungsflssigchromatograph mit UV-Detektor, der ein
24、e Messung bei 220 nm erlaubt und an ein Auswertsystem angeschlossen ist. 6.17 Analytische Trennsule1), Reversed Phase C 18, sphrisches Kieselgel, 250 mm 4 mm, 3 m bis 7 m 6.18 50-ml-Messkolben 7 Probenahme Bis zum Erscheinen einer in Vorbereitung befindlichen DIN-Norm ber die Probenahme ist diese zu
25、 verein-baren. Es ist von einer reprsentativen, gut durchmischten Probe auszugehen. 8 Durchfhrung 8.1 Probenvorbereitung Der Rstkaffee wird mit der Kaffeemhle nach 6.1 gemahlen und durch die Siebe nach 6.2 mit den Maschen-weiten 0,63 mm und 0,25 mm gesiebt. Dabei muss die Mahlung so eingestellt sein
26、, dass zwischen den beiden Sieben ein Kornanteil von mindestens 30 %2)bis hchstens 50 %2)erhalten wird. Die Einwaage fr die Bestim-mung wird mit dem Teil der Probe zwischen den beiden Sieben vorgenommen. Handelsblicher gemahlener Rstkaffee, der diesen Anforderungen nicht entspricht, muss nachgemahle
27、n werden. 1) ber Bezugsquellen gibt Auskunft: Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DIN Deutsches Institut fr Normung e. V., Burggrafenstrae 6, 10787 Berlin, Postanschrift 10772 Berlin 2) Massenanteil 6 DIN 10779:2011-03 8.2 Isolierung des Unverseifbaren 8.2.1 Fettex
28、traktion 5 g der nach 8.1 vorbereiteten Probe werden auf 0,01 g eingewogen, mit 20 g Natriumsulfat nach 5.11 im Mrser verrieben und 5 h mit tBME in einer Soxhlet-Extraktionsapparatur nach 6.5 extrahiert (Wasserbad 80 C, vier Ablufe je Stunde). Die Extraktion wird so abgebrochen, dass der grte Teil d
29、es Lsemittels in der Soxhletapparatur verbleibt. Anschlieend wird das Lsemittel am Vakuumrotationsverdampfer zum grten Teil abdestilliert. Die Lsung im Rundkolben wird unter Nachsplen mit tBME und Ultraschallbehandlung (1 min) in einen 50-ml-Messkolben berfhrt. Anschlieend wird mit tBME zunchst nur
30、bis zu einem Fllstand von etwa 45 ml aufgefllt. 8.2.2 Verseifung der Kaffeelipide Die nach 8.2.1 erhaltene Lsung wird unmittelbar vor der Weiterbearbeitung fr einige Minuten ins kalte Ultraschallbad gestellt und anschlieend mit tBME bis zur Marke aufgefllt (Lipidlsung). 20 ml der Lipidlsung werden i
31、n einen 250-ml-Rundkolben berfhrt. Der tBME wird am Rotationsverdampfer abgezogen. Unter Zugabe von einigen Siedesteinen sowie einer Spatelspitze Natriumascorbat wird mit 40 ml alkoholischer Kaliumhydroxidlsung nach 5.10 2 h unter Rckfluss verseift (Wasserbad 90 C). Anschlieend wird der Alkohol am R
32、otationsverdampfer bis auf 2 ml bis 3 ml Flssigkeit abdestilliert. Die Lsung wird mit insgesamt 80 ml etwa 70 C warmem Wasser schrittweise in einen 500-ml-Scheidetrichter berfhrt. Der Kolben wird mit 25 ml Methanol nachgewaschen. Anschlieend werden 20 ml 10 %ige Natriumchloridlsung (Variante: zustzl
33、ich 50 ml Methanol zur schnelleren Phasentrennung) zugegeben. Die Raumtemperatur sollte whrend der Extraktion nicht ber 22 C liegen. Die Mischung wird zweimal mit jeweils 100 ml tBME 3 min ausgeschttelt (nach der ersten Extraktion zwecks Phasentrennung gegebenenfalls ber Nacht stehen lassen). Es ist
34、 darauf zu achten, dass eine vollstndige Phasentrennung erreicht wird, notfalls werden einige Milliliter Methanol zugegeben. Auftretende Schlieren werden bei der ersten Extraktion in die wssrige Phase abgelassen; nach der zweiten Extraktion werden eventuell noch vorhandene Schlieren der Etherphase z
35、ugegeben. Die vereinigten Etherextrakte werden mit 100 ml 2 %iger Natriumchloridlsung gewaschen. Nach erfolgter Phasentrennung die obere Phase ist klar wird die Etherphase in einen mit 7,5 g Natriumsulfat nach 5.11 beschickten 250-ml-Rundkolben abgelassen, und der Scheidetrichter mit 10 ml tBME nach
36、gesplt. Nach vor-sichtigem Umschtteln werden die vereinigten Lsemittel 15 min ber Natriumsulfat getrocknet. Anschlieend wird die berstehende Etherlsung vorsichtig in einen weiteren 250-ml-Rundkolben abdekantiert. Lsemittelreste werden mit bergehendem Natriumsulfat auf ein Faltenfilter gegeben. Der K
37、olben mit dem restlichen Natriumsulfat wird zweimal mit jeweils 10 ml tBME gewaschen und die Lsung jeweils auf das Faltenfilter gegeben. Die gesammelten Etherlsungen werden am Rotationsverdampfer zur Trockene eingeengt. 8.2.3 Vorbereitung der Messlsung Der Rckstand wird im Ultraschallbad mit etwa 10
38、 ml Dichlormethan gelst und anschlieend quantitativ in einen 20-ml-Messkolben mit weiterem Dichlormethan bergefhrt. Schlielich wird bis zur Marke aufgefllt. 2 ml der Lsung werden in ein 4-ml-Glasvial pipettiert und im N2-Strom vorsichtig zur Trockene eingeengt. Der Rckstand wird in 2 ml Fliemittel n
39、ach 5.12 (Variante: in 2 ml Acetonitril nach 5.2) aufgenommen und kurz ins Ultraschallbad gestellt. Sollte die Lsung eine Trbung zeigen, wird eine Membranfiltration durchgefhrt. 7 DIN 10779:2011-03 8.2.4 Hochleistungsflssigchromatographie (HPLC) Bei Verwendung der Sule nach 6.17 hat sich die Einhalt
40、ung folgender Parameter bewhrt: Fliemittel: Acetonitril/Wasser 60:40 nach 5.12 Trennsule: nach 6.17 Injektionsvolumen: 20 l Durchfluss: 1 ml/min Detektion. 220 nm Die Linearitt der Kalibriergeraden im Arbeitsbereich ist durch Mehrpunktkalibrierung sicherzustellen. 9 Auswertung 9.1 Allgemeines Der Ge
41、halt an 16-O-Methylcafestol wird nach dem Verfahren des externen Standards ber die Peakflchen ermittelt. 9.2 Berechnung Der Gehalt wMan 16-O-Methylcafestol, angegeben als Massenanteil in mg/kg, wird bei Einpunktkalibrierung nach folgender Gleichung berechnet. EMx2EM31x50mAcAVmAVVcAw=M(1) Dabei ist A
42、x Flche des 16-O-Methylcafestolpeaks bei der Messung der Probenlsung, in Flcheneinheiten; c Massenkonzentration der 16-O-Methylcafestol-Standardlsung, in g/ml; AM Flche des 16-O-Methylcafestolpeaks bei der Messung der Standardlsung, in Flcheneinheiten; mE Einwaage der Probe, in g; V1 Volumen der Lip
43、idlsung nach 8.2.1 (50 ml); V2 Volumen der zur Verseifung eingesetzten Lipidlsung nach 8.2.2 (20 ml); V3 Volumen der Dichlormethanlsung nach 8.2.3 (20 ml). 10 Przision des Verfahrens 10.1 Allgemeines Die Przision des Verfahrens wurde in einem Ringversuch unter Beteiligung von 8 Laboratorien ermittel
44、t. Einzelheiten sind im Anhang A (normativ) angegeben. Die Auswertung erfolgte nach DIN ISO 5725. 8 DIN 10779:2011-03 10.2 Wiederholprzision Die absolute Differenz zwischen zwei einzelnen voneinander unabhngigen Untersuchungsergebnissen, die vom selben Bearbeiter mit dem gleichen Verfahren im selben
45、 Laboratorium an identischem Untersuchungs-material mit denselben Gerten innerhalb einer kurzen Zeitspanne erhalten werden, sollte nicht grer sein als der in der Tabelle A.1 angegebene Wert von r. 10.3 Vergleichprzision Die absolute Differenz zwischen zwei einzelnen Untersuchungsergebnissen, die von
46、 verschiedenen Bearbeitern mit dem gleichen Verfahren in verschiedenen Laboratorien an identischem Untersuchungsmaterial mit verschiedenen Gerten erhalten werden, sollte nicht grer sein, als der in der Tabelle A.1 angegebene Wert von R. 11 Untersuchungsbericht Im Untersuchungsbericht sind unter Verw
47、eisung auf diese Norm anzugeben: a) Art und Herkunft der Probe; b) Art der Probenahme; c) Gehalt an 16-O-Methylcafestol angegeben als Massenanteil in mg/kg Rstkaffee; d) Gegebenenfalls Abweichungen von den Festlegungen dieser Norm; e) Untersuchungsdatum. 9 DIN 10779:2011-03 Anhang A (normativ) Ergeb
48、nisse des Ringversuchs Tabelle A.1 Zusammenfassung der Ergebnisse Probe Probe AaProbe BaAnzahl der Laboratorien 8 8 Mittelwert (mg/kg) 257,6 130,1 Wiederholstandardabweichung sr11,7 5,9 Vergleichstandardabweichung sR29,9 12,8 Wiederholgrenze r 33,0 16,7Vergleichgrenze R 84,6 36,1aDie hier angegebene
49、n Werte gelten nur fr die Proben des Ringversuches. Die im Ringversuch untersuchten Proben waren Rstkaffeemischungen eines Arabica- mit einem Robustakaffee (20 % bzw. 10 % Robustaanteil).10 DIN 10779:2011-03 Anhang B (informativ) Beispiel fr ein Chromatogramm Chromatographie-Bedingungen: Trennsule: nach 6.17 Fliemittel
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