DIN 58909-2-2000 Haemostaseology - Determination of factor VIII coagulant activity (F VIII C) - Part 2 Reference measurement procedure using a synthetic peptide substrate《止血学 测定Ⅷ凝血.pdf

1、h DIN Deutsches Institut fr Normung e.V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise,nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e.V., Berlin, gestattet.Alleinverkauf der Normen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 Berlinh No part of this standard may be reproduced without the prior perm

2、ission of DIN Deutsches Institut fr Normung e.V., Berlin.Beuth Verlag GmbH, Berlin, has the exclusive right of sale for German Standards (DIN-Normen).Ref. Nr. DIN 58909-2 : 2000-03Preisgr. 07 Vertr.-Nr. 0007Mrz 2000DEUTSCHE NORMHmostaseologieBestimmung derFaktor VIII-Gerinnungsaktivitt (F VIII C)Tei

3、l 2: Referenzmeverfahren mit einem synthetischen Peptidsubstrat58909-2Normenausschu Medizin (NAMed) im DIN Deutsches Institut fr Normung e.V.Ersatz fr Ausgabe 1995-09Supersedes September 1995editionICS 11.100Haemostaseology Determination of factor VIII coagulant activity (F VIII C) Part 2: Reference

4、 measurement procedure using a synthetic peptide substrateHmostasiologie Dosage de lactivit coagulante du facteur VIII (F VIII C) Partie 2: Mode opratoire de mesure de rfrence laide dun substrat peptidiquesynthtiqueVorwortDiese Norm wurde vom Arbeitsausschu C 5 Hmosta-seologie“ des Normenausschusses

5、 Medizin (NAMed) imDIN Deutsches Institut fr Normung e. V. in Zusammenar-beit mit der Gesellschaft fr Thrombose- und Hmostase-forschung e.V. erarbeitet.DIN 58909 Bestimmung der Faktor VIII-Gerinnungsakti-vitt (F VIII C)“ besteht aus: Teil 1: Referenzmeverfahren fr die Einstufenme-thode Teil 2: Refer

6、enzmeverfahren mit einem synthetischenPeptidsubstratnderungenGegenber der Ausgabe September 1995 wurde fol-gende nderung vorgenommen: Die Norm wurde redaktionell berarbeitet.Frhere AusgabeDIN 58909-2: 1995-09Fortsetzung Seite 2 bis 5In case of doubt, the German-language version should beconsulted as

7、 the authoritative text.ForewordThis standard has been prepared by the Technical Com-mittee C 5 “Hmostaseologie” of the NormenausschuMedizin (Medicine Standards Committee) of DIN Deut-sches Institut fr Normung e. V. in cooperation with theGesellschaft fr Thrombose- und Hmostaseforschung e.V.DIN 5890

8、9 “Determination of factor VIII coagulant activity(F VIII C)” consists of: Part 1: Reference measurement procedure for theone-stage method Part 2: Reference measurement procedure using asynthetic peptide substrateAmendmentsThe following amendment has been made to theSeptember 1995 edition: The stand

9、ard has been editorially revised.Previous editionDIN 58909-2: 1995-09Continued on pages 2 to 5B55EB1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09CC9B7EF8DD9NormCD - Stand 2007-03 Seite 2DIN 58909-2 : 2000-031 AnwendungsbereichDiese Norm gilt fr die Bestimmung der Faktor VIII-Ge-rinnungsaktivitt (F VIII C) ber die B

10、estimmung von Fak-tor Xa mit einem chromogenen Peptidsubstrat in Plasmaund Faktorenkonzentraten.Zweck dieser Norm ist die Ermittlung vergleichbarerErgebnisse des Faktor VIII-Gehaltes in einem vorgege-benen Untersuchungsmaterial. Dabei ist ein einheitlichesVorgehen bei der Kalibrierung der Methode so

11、wie die Ver-wendung von Referenzplasmen bzw. -konzentraten mitdeklariertem Faktor VIII C-Anteil, der durch Kalibrierungam jeweils gltigen Internationalen Standard der WHO frFaktor VIII C ermittelt wurde, unerlliche Vorausset-zung.2 Normative VerweisungenDiese Norm enthlt durch datierte oder undatier

12、te Verwei-sungen Festlegungen aus anderen Publikationen. Diesenormativen Verweisungen sind an den jeweiligen Stellenim Text zitiert, und die Publikationen sind nachstehendaufgefhrt. Bei datierten Verweisungen gehren spterenderungen oder berarbeitungen dieser PublikationennurzudieserNorm,fallssiedurc

13、hnderungoderberar-beitung eingearbeitet sind. Bei undatierten Verweisungengilt die letzte Ausgabe der in Bezug genommenen Publi-kation.DIN 58905-1Hmostaseologie Blutentnahme Teil 1: Gewin-nung von vensem Citratplasma fr hmostaseologi-sche AnalysenDIN 58911-2Hmostaseologie Kalibrierung von Meverfahre

14、n Teil 2: Photometrische MeverfahrenDIN 58939-1Hmostaseologie Referenzplasma Teil 1: Anfor-derungen, HerstellungDIN 58963-3Kvetten fr photometrische Messungen Einmal-Rechteckkvetten aus Kunststoffen Mae, Anforde-rungen3BegrifeFr die Anwendung dieser Norm gelten die folgendenBegriffe:3.1 Faktor VIII

15、CFaktor VIII-Gerinnungsaktivitt3.2 Faktor VIII C-Bestimmung mitchromogenem SubstratBestimmung durch Umwandlung von Faktor X inFaktor Xa, die enzymatisch durch einen Komplex,den Faktor VIIIa-Faktor IXa-Phospholipid-Ca2+-Komplex,initiiert wird.ANMERKUNG 1: Die Konzentration an gebildetem Fak-tor Xa is

16、t proportional zur Konzentration desFaktors VIII CinderProbe.ANMERKUNG 2: Die Faktor Xa-Aktivitt wird mit Hilfeeines spezifischen chromogenen Peptidsubstratesbestimmt.3.3 Chromogenes Peptidsubstrat fr Faktor XaEin synthetisches Oligopeptid, das am C-terminalen Endeeine chromophore Gruppe trgt, die d

17、urch Faktor Xaabgespalten wird.1ScopeThis standard is applicable to the determination offactor VIII coagulant activity (F VIII C) via the determina-tion of factor Xa with a chromogenic peptide substrate inplasma and factor concentrates.The purpose of this standard is to achieve comparableresults for

18、 the factor VIII contentinagivenspecimen.Essential preconditions for achieving this objective are astandardized procedure for calibration of the method, aswell as the use of reference plasmas or reference concen-trates with an assigned factor VIII C proportion which hasbeen determined by calibration

19、 against the InternationalStandard of WHO for factor VIII C which is valid at thetime of use.2 Normative referencesThis standard incorporates by dated or undated referenceprovisions from other publications. These normative refer-ences are cited at the appropriate places in the text andthe publicatio

20、ns are listed hereafter. For dated references,subsequent amendments to or revisions of any of thesepublications apply to this standard only when incorpo-rated in it by amendment or revision. For undated refer-ences the latest edition of the publication referred toapplies.DIN 58905-1Haemostaseology B

21、lood collection Part 1: Prep-aration of plasma from citrated venous blood for coag-ulation testingDIN 58911-2Haemostaseology Calibration of measurement pro-cedures Part 2: Photometric measurement proce-duresDIN 58939-1Haemostaseology Reference plasma Part 1:Requirements, preparationDIN 58963-3Optica

22、l cells for photometric measurements Dis-posable rectangular spectrophotometric cells Dimensions, requirements3 Terms and definitionsFor the purposes of this standard, the following terms anddefinitions apply:3.1 Factor VIII CFactor VIII coagulant activity3.2 Determination of factor VIII Cusinga chr

23、omogenic substrateDetermination based on the transformation of factor X tofactor Xa, initiated enzymatically by a factor VIIIa/fac-tor IXa/phospholipid/Ca2+complex.NOTE 1: The concentration of factor Xa being producedis proportional to that of the factor VIII Cinthesample.NOTE 2: To determine the fa

24、ctor Xa activity, a specificchromogenic peptide substrate is required.3.3 Chromogenic peptide substrate for factor XaA synthetic oligopeptide with a factor Xa-degradablechromophore group at the C-terminal.B55EB1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09CC9B7EF8DD9NormCD - Stand 2007-03 Seite 3DIN 58909-2 : 2000-

25、033.4 Faktor XaEin proteolytisches Enzym (EC 3.4.21.6)1), das durch Pro-teolyse aus dem Proenzym Faktor X entsteht.3.5 Faktor VIII C-NormalaktivittFaktor VIII C in einem frischen gepoolten Normalplasmanach DIN 58911-2.ANMERKUNG: Die Faktor VIII C-Normalaktivitt betrgtdefinitionsgem 100% oder 1 Inter

26、nationale Einheitje ml Plasma 1, 2.3.6 Faktor VIII C-ReferenzplasmaGepooltes Normalplasma, z. B. nach DIN 58939-1, das bei709C tiefgefroren bzw. lyophilisiert gelagert und dessenFaktor VIII C am jeweils gltigen Internationalen Stan-dard der WHO fr Faktor VIII Ckalibriertwird.ANMERKUNG: Faktor VIII C

27、-Referenzplasma dient zurKalibrierung und kann auch zur Erstellung einerBezugskurve verwendet werden.3.7 Faktor VIII C-ReferenzkonzentratEin lyophilisiertes Faktor VIII-Konzentrat, dessenFaktor VIII C an dem jeweils gltigen InternationalenKonzentratstandard der WHO fr Faktor VIII C kalibriertwird.AN

28、MERKUNG: Faktor VIII C-Referenzkonzentrat dientzur Kalibrierung und kann auch zur Erstellung einerBezugskurve verwendet werden.3.8 Faktor VIII C-KalibrierplasmaEin frisches, tiefgefrorenes oder lyophilisiertes gepooltesPlasma von mindestens zehn gesunden Spendern, dasan einem Faktor VIII C-Referenzp

29、lasma kalibriert wird.ANMERKUNG 1: Das Faktor VIII C-Kalibrierplasma dientzur Erstellung der Bezugskurve nach DIN 58911-2.ANMERKUNG 2: Verdnnungen zur Mehrpunktkalibrie-rung sind zulssig, soweit diese den Kalibrierbezie-hungen eines adquat verdnnten Faktor VIII C-Refe-renznormalplasmas entsprechen (

30、siehe DIN 58911-2).4 BezeichnungBezeichnung der Bestimmung des Faktors VIII Cmiteinem chromogenen Peptidsubstrat:BestimmungDIN 58909 F8 C chromogen5 Entnahme und Aufbereitung des BlutesDie Entnahme und Aufbereitung des Blutes erfolgen nachDIN 58905-1.DiePlasmaprobedarfbiszu2hnachderBlutentnahmebei e

31、iner Temperatur im Bereich von 189Cbis229Cauf-bewahrt werden. Sofern die Bestimmung innerhalb dieserZeitspanne nicht mglich ist, darf die Plasmaprobe nachDIN 58905-1 eingefroren werden.1)Bezeichnung nach IUPAC (International Union of Pureand Applied Chemistry)3.4 Factor XaA proteolytic enzyme (EC 3.

32、4.21.6)1)which is producedfrom the proenzyme factor X by proteolysis.3.5 Factor VIII C normal activityFactor VIII C in a fresh pooled normal plasma as speci-fied in DIN 58911-2.NOTE: The factor VIII C normal activity is defined as100% or 1 International Unit per ml of plasma 1, 2.3.6 Factor VIII C r

33、eference plasmaPooled normal plasma, e.g. as specified in DIN 58939-1,which is stored deep-frozen at 709C or lyophilized andthe factor VIII C thereof is calibrated against the Interna-tional Standard of WHO for factor VIII Cwhichisvalidatthe time of use.NOTE: Factor VIII C reference plasma serves fo

34、r calibra-tion and can also be used for establishing a referencecurve.3.7 Factor VIII C reference concentrateA lyophilized factor VIII concentrate, the factor VIII Cofwhich is calibrated against the International ConcentrateStandard of WHO for factor VIII Cwhichisvalidatthetime of use.NOTE: Factor V

35、III C reference concentrate serves forcalibration and can also be used for establishing a ref-erence curve.3.8 Factor VIII C calibration plasmaA fresh, deep-frozen, or lyophilized pooled plasmaobtained from at least ten healthy donors which is cali-brated against a factor VIII Creferenceplasma.NOTE

36、1: The factor VIII C calibration plasma is used forestablishing the reference curve as specified inDIN 58911-2.NOTE 2: Dilutions for multi-point calibration are permittedas long as they match the calibration ratio of an ade-quately diluted factor VIII C normal reference plasma(see DIN 58911-2).4Desi

37、gnationDesignation of the determination of factor VIII Cusingachromogenic peptide substrate:DeterminationDIN 58909 F8 C chromogenic5 Collection and processing of bloodThe collection and processing of blood shall be carriedout as described in DIN 58905-1.Theplasmasamplemaybestoredupto2hafterbloodcole

38、ctionatatemperatureintherangefrom189Cto229C. Unless the determination can be performed withinthis period of time, the plasma sample may be frozen asdescribed in DIN 58905-1.1)Designation as specified by IUPAC (International Unionof Pure and Applied Chemistry)B55EB1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09CC9B7E

39、F8DD9NormCD - Stand 2007-03 Seite 4DIN 58909-2 : 2000-036 Durchfhrung2)6.1 Vorbereitung der Proben und ReagenzienDie Probe wird nach den Angaben des Reagenzienher-stellers mit albuminhaltigem Puffer mit einem pH-Wertvon etwa 7,4 vorverdnnt. Die vorverdnnte Probe darf vorder Bestimmung nicht lnger al

40、s 1 h aufbewahrt werden.Faktor VIII C-Konzentrate sind mit einem Puffer, der min-destens 1% Humanalbumin enthlt, auf etwa 1 I.E/ml vor-zuverdnnen. Die vorverdnnte Probe darf vor derBestimmung nicht lnger als 1 h bei Raumtemperatur auf-bewahrt werden.ANMERKUNG: Die Reaktionsbedingungen knnen modi-fiz

41、iert werden, sofern vergleichbare Ergebnisse erhal-ten werden.DieReagenzienzurFaktorVIII C-Bestimmung enthaltenPhospholipid, Calcium, Faktor X,FaktorIXaunddenFak-tor VIII-Aktivator Thrombin. Die Reagenzien mit denGerinnungsfaktoren drfen keine Verunreinigungen ent-halten, die die Aktivierung von Fak

42、tor VIII oder Faktor Xbeeinflussen.Die Phospholipidkonzentration im Testansatz sollte zwi-schen 10 mmol/l und 50 mmol/l betragen. Die Konzentra-tion der Calciumionen im Testansatz sollte zwischen5mmol/l und 15 mmol/l betragen. Die fr die Gesamtre-aktion notwendigen Bestandteile knnen in zwei odermeh

43、r Reagenzien vorliegen; die Zusammensetzung derEinzelreagenzien ist so zu whlen, da Faktor Xanichtspontan gebildet werden kann.Die Bildung des aktivierten Faktors VIII Cerfolgtdurchden Faktor VIII-Aktivator, vorzugsweise durch Thrombin.Faktor VIIIa bildet mit den Komponenten Faktor IXa,Phospholipid

44、und Calcium einen Komplex, der in der Lageist, Faktor X zu Faktor Xa zu spalten. Die KonzentrationenderFaktorenimTestansatzsindsozuwhlen,dadieGeschwindigkeit der enzymatischen Spaltung des Fak-tors X ber die Inkubationsdauer linear verluft. Die gebil-dete Faktor Xa-Aktivitt wird mittels eines chromo

45、genenSubstrates bestimmt. Um eine weitere Faktor Xa-Bildungwhrend der Nachweisreaktion zu unterbinden, wird einKomplexbildner fr Calcium (z. B. EDTA) in ausreichenderMenge zugegeben.Es mu sichergestellt werden, da das Substrat nichtdurch Thrombin gespalten wird; das kann zweckmiger-weise durch den Z

46、usatz eines Thrombininhibitors erreichtwerden.6.2 Photometrische MessungDie Messung wird bei der vom Hersteller des Substratsangegebenen Wellenlnge durchgefhrt. Es sind Einmal-Rechteckkvetten nach DIN 58963-3 zu verwenden.6.3 ReaktionsansatzDie Reaktion wird in zwei Schritten durchgefhrt. Imersten S

47、chritt wird die Probe mit den AktivatorreagenzienFaktor X,FaktorIXa, Faktor VIIIa-Aktivator, Phospholipidund Calciumionen inkubiert. Im zweiten Schritt wird diegebildete Faktor Xa-Aktivitt bestimmt. Dazu wird dasReaktionsgemisch mit Substratlsung, einem Throm-bininhibitor und einem Inhibitor gegen die Neubildung vonFaktor Xa versetzt.DieReagenzienunddieKvettensindauf(37t 0,5)9Cvorzuwrmen. Die vorverdnnte Probe und die Reagen-zien werden dann nach den Angaben des Reagenzien-herstellers in die Kvette pipettiert und inkubiert. Na