1、Mrz 2006DEUTSCHE NORM Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DINPreisgruppe 13DIN Deutsches Institut fr Normung e.V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e.V., Berlin, gestattet.ICS 67.050!,cP“96457
2、45www.din.deDDIN EN 14663Lebensmittel Bestimmung von Vitamin B6 (einschlielich glucosidisch gebundenerVerbindungen) mit HPLC;Deutsche Fassung EN 14663:2005Foodstuffs Determination of vitamin B6 (including its glycosylated forms) by HPLC;German version EN 14663:2005Produits alimentaires Dosage de la
3、vitamine B6 (y compris ses formes glycosyles) par CLHP;Version allemande EN 14663:2005Alleinverkauf der Normen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 Berlin www.beuth.deGesamtumfang 25 SeitenDIN EN 14663:2006-03 2 Nationales Vorwort Diese Europische Norm ist vom Technischen Komitee CEN/TC 275 Lebensmittelan
4、alytik Horizontale Verfahren (Sekretariat: DIN) erarbeitet worden. Die Mitarbeit des DIN wird ber den Arbeitsausschuss Vitamine des Normenausschusses Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) wahrgenommen. Fr die im Inhalt zitierten Normen wird im Folgenden auf die entsprechende Deutsche N
5、orm hingewiesen: EN ISO 3696 siehe DIN ISO 3696 ISO 5725 siehe DIN ISO 57251)Nationaler Anhang NA (informativ) Literaturhinweise DIN ISO 3696, Wasser fr analytische Zwecke Anforderungen und Prfungen DIN ISO 5725, Przision von Messverfahren Ermittlung der Wiederhol- und Vergleichprzision von festgele
6、gten Messverfahren durch Ringversuche1)1) Diese Norm, die fr die Ermittlung der Przisionsdaten verwendet wurde, ist inzwischen zurckgezogen und durch DIN ISO 5725-1:1997-11 und DIN ISO 5725-2:2002-12 ersetzt worden. EUROPISCHE NORM EUROPEAN STANDARD NORME EUROPENNE EN 14663 Dezember 2005 ICS 67.050
7、Deutsche Fassung Lebensmittel Bestimmung von Vitamin B6 (einschlielich glucosidisch gebundener Verbindungen) mit HPLC Foodstuffs Determination of vitamin B6 (including its glycosylated forms) by HPLC Produits alimentaires Dosage de la vitamine B6 (y compris ses formes glycosyles) par CLHP Diese Euro
8、pische Norm wurde vom CEN am 26. Oktober 2005 angenommen. Die CEN-Mitglieder sind gehalten, die CEN/CENELEC-Geschftsordnung zu erfllen, in der die Bedingungen festgelegt sind, unter denendieser Europischen Norm ohne jede nderung der Status einer nationalen Norm zu geben ist. Auf dem letzten Stand be
9、findliche Listendieser nationalen Normen mit ihren bibliographischen Angaben sind beim Management-Zentrum oder bei jedem CEN-Mitglied auf Anfrage erhltlich. Diese Europische Norm besteht in drei offiziellen Fassungen (Deutsch, Englisch, Franzsisch). Eine Fassung in einer anderen Sprache,die von eine
10、m CEN-Mitglied in eigener Verantwortung durch bersetzung in seine Landessprache gemacht und dem Management-Zentrum mitgeteilt worden ist, hat den gleichen Status wie die offiziellen Fassungen. CEN-Mitglieder sind die nationalen Normungsinstitute von Belgien, Dnemark, Deutschland, Estland, Finnland,
11、Frankreich, Griechenland,Irland, Island, Italien, Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta, den Niederlanden, Norwegen, sterreich, Polen, Portugal, Schweden, derSchweiz, der Slowakei, Slowenien, Spanien, der Tschechischen Republik, Ungarn, dem Vereinigten Knigreich und Zypern. EUROPISCHES KOMITEE FR NORM
12、UNG EUROPEAN COMMITTEE FOR STANDARDIZATION COMIT EUROPEN DE NORMALISATIONManagement-Zentrum: rue de Stassart, 36 B-1050 Brssel 2005 CEN Alle Rechte der Verwertung, gleich in welcher Form und in welchem Verfahren, sind weltweit den nationalen Mitgliedern von CEN vorbehalten.Ref. Nr. EN 14663:2005 DEN
13、 14663:2005 (D) 2 Inhalt Seite Vorwort 3 1 Anwendungsbereich .4 2 Normative Verweisungen4 3 Kurzbeschreibung .4 4 Reagenzien .4 5 Gerte9 6 Durchfhrung.10 7 Berechnung12 8 Przision .13 9 Untersuchungsbericht 15 Anhang A (informativ) Przisionsdaten 16 Anhang B (informativ) Beispiele fr geeignete HPLC-
14、Bedingungen fr die Bestimmung von Vitamin B6-Verbindungen20 Anhang C (informativ) Beispiele fr molare Extinktionskoeffizienten.21 Anhang D (informativ) Bilder22 Literaturhinweise 23 Bilder Bild D.1 Standardsubstanzen und Probe Kartoffelpree 22 Tabellen Tabelle 1 Beispiele fr molare Extinktionskoeffi
15、zienten von Vitamin B6-Verbindungen 7 Tabelle A.1 Przisionsdaten fr Griesbrei mit Milch, als Pulver 16 Tabelle A.2 Przisionsdaten fr Kartoffelpree, als Pulver17 Tabelle A.3 Przisionsdaten fr Gemse mit Schinken (Kleinkindernahrung) 18 Tabelle A.4 Przisionsdaten fr ein Multivitamingetrnk .19 Tabelle B
16、.1 Beispiele fr geeignete HPLC-Bedingungen fr die Bestimmung von Vitamin B6-Verbindungen 20 Tabelle C.1 Beispiele fr molare Extinktionskoeffizienten (E) von Vitamin B6-Verbin- dungen 3, 4. 21 EN 14663:2005 (D) 3 Vorwort Dieses Dokument (EN 14663:2005) wurde vom Technischen Komitee CEN/TC 275 Lebensm
17、ittelanalytik Horizontale Verfahren“ erarbeitet, dessen Sekretariat vom DIN gehalten wird. Diese Europische Norm muss den Status einer nationalen Norm erhalten, entweder durch Verffentlichung eines identischen Textes oder durch Anerkennung bis Juni 2006, und etwaige entgegenstehende nationale Normen
18、 mssen bis Juni 2006 zurckgezogen werden. Entsprechend der CEN/CENELEC-Geschftsordnung sind die nationalen Normungsinstitute der folgenden Lnder gehalten, diese Europische Norm zu bernehmen: Belgien, Dnemark, Deutschland, Estland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Lettland
19、, Litauen, Luxemburg, Malta, Niederlande, Norwegen, sterreich, Polen, Portugal, Schweden, Schweiz, Slowakei, Slowenien, Spanien, Tschechische Republik, Ungarn, Vereinigtes Knigreich und Zypern. EN 14663:2005 (D) 4 1 Anwendungsbereich Dieses Dokument legt ein Verfahren fr die Bestimmung von Vitamin B
20、6 in Lebensmitteln mit Hochleistungs-Flssigchromatographie (HPLC) fest. Vitamin B6ist der Massenanteil der Summe von Pyridoxin, Pyridoxal und Pyridoxamin einschlielich ihrer phosphorylierten Verbindungen, wie auch von -glycosylierten Verbindungen, berechnet als Pyridoxin. Dieses Verfahren wurde im R
21、ingversuch erfolgreich fr Massenanteile von 0,034 mg/100 g bis 1,21 mg/100 g in Milch-Griesbrei (Kleinkindernahrung), Kartoffelpree, Schinken mit Gemse (Fertignahrung) und einem Multivitamingetrnk validiert. 2 Normative Verweisungen Die folgenden zitierten Dokumente sind fr die Anwendung dieses Doku
22、ments erforderlich. Bei datierten Verweisungen gilt nur die in Bezug genommene Ausgabe. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe des in Bezug genommenen Dokuments (einschlielich aller nderungen). EN ISO 3696, Wasser fr analytische Zwecke Anforderungen und Prfungen (ISO 3696:1987) 3 Kurzb
23、eschreibung Pyridoxal, Pyridoxamin und Pyridoxin werden aus dem Lebensmittel durch saure Hydrolyse extrahiert und mit saurer Phosphatase und -Glucosidase enzymatisch dephosphoryliert und deglycosiliert. Die verschiedenen Vitamin B6-Derivate (Pyridoxal, Pyridoxamin und Pyridoxin) werden mit HPLC getr
24、ennt und mit fluorometrischer Detektion quantifiziert 1, 2. 4 Reagenzien 4.1 Allgemeines Falls nicht anders angegeben, werden bei der Analyse nur analysenreine Chemikalien und Wasser von mindestens Qualitt 1 nach EN ISO 3696 oder doppelt destilliertes Wasser verwendet. 4.2 Dikaliumhydrogenphosphat,
25、Massenanteil w(K2HPO4 3 H2O) 99,9 % 4.3 Natriumacetat, ohne Kristallwasser, w(CH3COONa) 99,0 % 4.4 Trichloressigsure (TCA), w(Cl3CCOOH) 99,0 % 4.5 Natriumacetat-Lsung, Stoffmengenkonzentration c(CH3COONa) = 2,5 mol/l 205 g Natriumacetat (4.3) werden in 1 l Wasser gelst. 4.6 Nachsulenreagenz (wahlwei
26、se), K2HPO4-Lsung, c(K2HPO4) = 0,15 mol/l 34,2 g Dikaliumhydrogenphosphat (4.2) werden in Wasser gelst, auf 1 000 ml aufgefllt, gemischt und entgast. EN 14663:2005 (D) 5 4.7 Salzsure, c(HCl) = 1 mol/l 4.8 Salzsure, c(HCl) = 0,1 mol/l 4.9 Salzsure, c(HCl) = 0,2 mol/l 4.10 Schwefelsure, c(H2SO4)= 1 mo
27、l/l 4.11 Petroleumbenzin, Siedebereich von 40 C bis 60 C 4.12 Saure Phosphatase, von Kartoffeln, enzymatische Aktivitt etwa 5,3 U/mg1). Es ist wichtig, dass das verwendete Enzym der Aktivittsprfung 4.13.2 entspricht. Weitere Informationen, siehe 2, 7. 4.13 Saure Phosphatase-Lsung 4.13.1 Allgemeines
28、60 mg Saure Phosphatase (4.12) werden in einem Becherglas in 10 ml Wasser durch 2-mintiges Rhren gelst bzw. solubilisiert. Diese Lsung wird an jedem Analysentag hergestellt. 4.13.2 Aktivittsprfung der sauren Phosphatase 10 g Schweinefleisch, 5 g Kartoffelpree oder 5 g Vollkornmehl werden in ein Bech
29、erglas eingewogen und wie in 6.2.1 beschrieben, sauer extrahiert. 1 ml Saure Phosphatase-Lsung (4.13.1) und wahlweise 1 ml -Glucosidase-Lsung (4.15) werden zu 12,5 ml der extrahierten Probenlsung gegeben und gemischt. Die Lsung wird mindestens 12 h oder ber Nacht bei 37 C unter dauerndem Rhren inkub
30、iert. Dieser Schritt wird mit der doppelten Menge an Saure Phosphatase-Lsung wiederholt. Die Massenkonzentration der Vitamine werden nach 6.6 bestimmt. Die Enzymaktivitt ist ausreichend, wenn die entsprechenden Massenkonzentrationen der Vitamin B6-Verbindungen in beiden Probenlsungen gleich sind. Da
31、s Chromatogram darf keinen Peak aufweisen, der von Pyridoxaminphosphat herrhrt. ANMERKUNG Im Ringversuch wurde die Saure Phosphatase von Sigma Nr P 37522)verwendet. 4.14 -Glucosidase, von Mandeln, enzymatische Aktivitt etwa 3,2 U/mg. Es ist wichtig, dass das verwendete Enzym der Aktivittsprfung 4.15
32、.2 entspricht. Weitere Informationen siehe 2, 7. 4.15 -Glucosidase Lsung 4.15.1 Allgemeines 100 mg -Glucosidase (4.14) werden in einem Becherglas in 10 ml Wasser durch 2-mintiges Rhren gelst/solubilisiert. Diese Lsung wird an jedem Analysentag hergestellt. 1) U, Diese Einheit (oft auch International
33、e Einheit (International Unit IU) oder Standardeinheit) ist definiert als die Menge an Enzym, die 1 mol Substrat je Minute unter standardisierten Bedingungen umsetzt. 2) Diese Angabe dient nur zur Unterrichtung der Anwender dieser Norm und bedeutet keine Anerkennung des genannten Produkts durch CEN.
34、 Gleichwertige Produkte drfen verwendet werden, wenn sie nachweisbar zu identischen Ergebnissen fhren. EN 14663:2005 (D) 6 4.15.2 Aktivittsprfung der -Glucosidase 10 g Schweinefleisch, 5 g Kartoffelpree oder 5 g Vollkornmehl werden in ein Becherglas eingewogen und wie in 6.2.1 beschrieben, sauer ext
35、rahiert. 1 ml Saure Phosphatase-Lsung (4.13.1) und 1 ml -Glucosidase-Lsung (4.15) werden zu 12,5 ml der extrahierten Probenlsung gegeben und gemischt. Die Lsung wird mindestens 12 h oder ber Nacht bei 37 C unter dauerndem Rhren inkubiert. Dieser Schritt wird mit der doppelten Menge an -Glucosidase-L
36、sung wiederholt. Die Massenkonzentration der Vitamin B6-Verbindungen wird nach 6.6 bestimmt. Die Enzymaktivitt ist ausreichend, wenn die entsprechenden Massenkonzentrationen der Vitamin B6-Verbindungen in beiden Probenlsungen gleich sind. Das Chromatogram darf keinen Peak aufweisen, der von Pyridoxa
37、minphosphat herrhrt. ANMERKUNG Im Ringversuch wurde die -Glucosidase von Sigma Nr G-03953)verwendet. 4.16 Mobile Phase fr die HPLC, (Schwefelsure, c(H2SO4)= 0,015 mol/l enthaltend 0,005 mol/l TCA) 817 mg 5 mg Trichloressigsure (4.4) werden in 15 ml 1 mol/l Schwefelsure (4.10) gelst, in einen 1 000-m
38、l-Messkolben berfhrt, die Lsung wird bis zur Marke mit Wasser aufgefllt, gemischt und entgast. 4.17 Silikonl, zum Entschumen 4.18 Standardsubstanzen 4.18.1 Allgemeines Pyridoxamin (PM), Pyridoxal (PL) und Pyridoxin (PN) knnen von verschiedenen Lieferanten bezogen werden. Die Reinheit der Standardsub
39、stanzen kann variieren, und daher ist es erforderlich, die Konzentration und Reinheit zu bestimmen (siehe 4.19.4 und 4.20.7). 4.18.2 Pyridoxamindihydrochlorid (PM Dihydrochlorid), w(C8H12N2O2 2HCl) 98 % 4.18.3 Pyridoxalhydrochlorid (PL Hydrochlorid), w(C8H9NO3 HCl) 98 % 4.18.4 Pyridoxinhydrochlorid
40、(PN Hydrochlorid), w(C8H11NO3 HCl) 98 % 4.19 Stammlsungen 4.19.1 Pyridoxamin (PM) Stammlsung, Massenkonzentration (PM) etwa 500 g/ml 71,7 mg Pyridoxamindihydrochlorid (4.18.2) werden in einem 100-ml-Messkolben in 0,1 mol/l HCl (4.8) gelst, und der Messkolben wird mit 0,1 mol/l HCl bis zur Marke aufg
41、efllt. Die Lsung kann ohne Verluste bis zu einer Woche bei 4 C oder bis zu zwei Monaten bei 18 C aufbewahrt werden. 4.19.2 Pyridoxal (PL) Stammlsung, (PL) etwa 500 g/ml 60,9 mg Pyridoxalhydrochlorid (4.18.3) werden in einem 100-ml-Messkolben in 0,1 mol/l HCl (4.8) gelst, und der Messkolben wird mit
42、0,1 mol/l HCl bis zur Marke aufgefllt. Die Lsung kann ohne Verluste bis zu einer Woche bei 4 C oder bis zu zwei Monaten bei 18 C aufbewahrt werden. 3) Diese Angabe dient nur zur Unterrichtung der Anwender dieser Norm und bedeutet keine Anerkennung des genannten Produkts durch CEN. Gleichwertige Prod
43、ukte drfen verwendet werden, wenn sie nachweisbar zu identischen Ergebnissen fhren EN 14663:2005 (D) 7 4.19.3 Pyridoxin (PN) Stammlsung, (PN) etwa 500 g/ml 60,8 mg Pyridoxinhydrochlorid (4.18.4) werden in einem 100-ml-Messkolben in 0,1 mol/l HCl (4.8) gelst, und der Messkolben wird mit 0,1 mol/l HCl
44、 bis zur Marke aufgefllt. Die Lsung kann ohne Verluste bis zu einer Woche bei 4 C oder bis zu zwei Monaten bei 18 C aufbewahrt werden. 4.19.4 Prfung der Konzentration 1 ml der Stammlsungen von Pyridoxamin (4.19.1), Pyridoxal (4.19.2) und Pyridoxin (4.19.3) werden jeweils in einen 50-ml-Messkolben pi
45、pettiert und dieser bis zur Marke mit 0,1 mol/l HCl (4.8) aufgefllt. Die Extinktion wird im Absorptionsmaximum einer 1 cm Quarzkvette gegen 0,1 mol/l HCl im UV-Spektralphotometer bestimmt (siehe Tabelle 1). Die Massenkonzentration jeder Vitamin B6-Verbindung, iwird mit Gleichung (1) unter Bercksicht
46、igung der molaren Extinktionskoeffizienten berechnet: FVMA=iii (1) Dabei ist idie Massenkonzentration an Pyridoxamin, Pyridoxal und Pyridoxin, in Mikrogramm je Milliliter Stammlsung; A die Extinktion von PM, PL oder PN im Maximum max(siehe Tabelle 1); ider molare Extinktionskoeffizient von PM, PL od
47、er PN bei dem pH-Wert nach Tabelle 1; Midas Molgewicht von PM, PL und PN nach Tabelle 1; V der Verdnnungsfaktor, in diesem Falle V = 50; F der Umrechnungsfaktor von HCl freien Vitamin B6-Verbindungen. Die Massenkonzentrationen werden eingesetzt, um die genauen Konzentrationen von 4.19.1 bis 4.19.3 u
48、nd 4.20.1 bis 4.20.6 zu berechnen. Tabelle 1 Beispiele fr molare Extinktionskoeffizienten von Vitamin B6-Verbindungen Verbindung Lsemittel maximmol-1cm-1Mi g mol -1F PM 2 HCla 0,1 mol/l HCl, pH 1 292 8,2 241,1 0,698 PL HClb 0,1 mol/l HCl, pH 1 288 9,0 203,6 0,821 PN HClc 0,1 mol/l HCl, pH 1 291 8,6 205,6 0,823 aPM 2 HCl = Pyridoxamin-dihydrochlorid (4.18.2) bPL HCl = Pyridoxal-hydrochlorid (4.18.3) cPN HCl = Pyridoxin-hydrochlorid (4.18.4) EN 14663:2005 (D) 8 4.20 Standardlsungen 4.20.1 Pyridoxamin (PM) Standardlsung I, (PM) etwa 10 g/ml 2 ml PM-Stammlsung (4.19.1) werd
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