1、Juni 2008DEUTSCHE NORM Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DINPreisgruppe 12DIN Deutsches Institut fr Normung e.V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e.V., Berlin, gestattet.ICS 07.100.30; 67.1
2、00.10!$I:“1389123www.din.deDDIN EN ISO 13366-1Milch Zhlung somatischer Zellen Teil 1: Mikroskopisches Verfahren (Referenzverfahren)(ISO 13366-1:2008);Deutsche Fassung EN ISO 13366-1:2008Milk Enumeration of somatic cells Part 1: Microscopic method (Reference method) (ISO 13366-1:2008);German version
3、EN ISO 13366-1:2008Lait Dnombrement des cellules somatiques Partie 1: Mthode au microscope (Mthode de rfrence) (ISO 13366-1:2008);Version allemande EN ISO 13366-1:2008Alleinverkauf der Normen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 BerlinErsatz frDIN EN ISO 13366-1:1997-09www.beuth.deGesamtumfang 24 SeitenDI
4、N EN ISO 13366-1:2008-06 2 Nationales Vorwort Die Europische Norm (EN ISO 13366-1:2008) fllt in den Zustndigkeitsbereich des Technischen Komitees CEN/TC 302 Milch und Milchprodukte Probenahme- und Untersuchungsverfahren“ (Sekretariat: NEN, Niederlande). Die ihr zugrunde liegende Internationale Norm
5、ISO 13366-1:2008 wurde vom Unterkomitee SC 5 Milk and milk products“ (Sekretariat: NEN, Niederlande) des Technischen Komitees ISO/TC 34 Food products“ (Sekretariat: MSZT, Ungarn) ausgearbeitet. Aufgrund der Ergebnisse des parallelen Abstimmungsverfahrens wurde ISO 13366-1:2008 als Europische Norm EN
6、 ISO 13366-1:2008 bernommen. Die Mitarbeit des DIN beim Europischen Komitee fr Normung (CEN) wird fr das CEN/TC 302 Milch und Milchprodukte Probenahme- und Untersuchungsverfahren“ (Sekretariat: NEN, Niederlande) ber den DIN-Arbeitsausschuss Milch und Milchprodukte Probenahme- und Untersuchungsverfah
7、ren“ des Normenausschusses Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) wahrgenommen. DIN EN ISO 13366, Milch Zhlung somatischer Zellen besteht aus: Teil 1: Mikroskopisches Verfahren (Referenzverfahren) Teil 2: Leitfaden zum Betrieb fluoreszenzoptoelektronischer Zhlgerte Fr die in diesem Doku
8、ment zitierten internationalen Dokumente wird im Folgenden auf die entsprechenden deutschen Dokumente hingewiesen: ISO 707 siehe DIN EN ISO 707 ISO 5725-1 siehe DIN ISO 5725-1 ISO 5725-2 siehe DIN ISO 5725-2 nderungen Gegenber DIN EN ISO 13366-1:1997-09 wurden folgende nderungen vorgenommen: a) der
9、Abschnitt Normative Verweisungen wurde eingefgt; b) die Abschnitte Durchfhrung sowie Berechnung und Darstellung der Ergebnisse wurden grundlegend berarbeitet, um insbesondere die Auszhlung der Zellen genauer zu beschreiben; c) in einem Anhang A (informativ) werden die Ergebnisse eines Ringversuchs d
10、argestellt, im Anhang B (informativ) werden Hinweise zum Frben von Ziegenmilch gegeben, und der Anhang C (informativ) beschreibt die Poisson-Verteilung der Zellen in Milch; d) die Norm wurde technisch und redaktionell berarbeitet und ergnzt und damit an die derzeit gltigen Gestaltungsregeln angepass
11、t; e) die Literaturhinweise wurden ergnzt. Frhere Ausgaben DIN EN ISO 13366-1: 1997-09 DIN EN ISO 13366-1:2008-06 3 Nationaler Anhang NA (informativ) Literaturhinweise DIN EN ISO 707, Milch und Milchprodukte Leitfaden zur Probenahme DIN ISO 5725-1, Genauigkeit (Richtigkeit und Przision) von Messverf
12、ahren und Messergebnissen Teil 1: Allgemeine Grundlagen und Begriffe DIN ISO 5725-2, Genauigkeit (Richtigkeit und Przision) von Messverfahren und Messergebnissen Teil 2: Grundlegende Methode fr die Ermittlung der Wiederhol- und Vergleichprzision eines vereinheitlichten Messverfahrens DIN EN ISO 1336
13、6-1:2008-06 4 Leerseite EUROPISCHE NORM EUROPEAN STANDARD NORME EUROPENNE EN ISO 13366-1 Februar 2008 ICS 67.100.10 Ersatz fr EN ISO 13366-1:1997 Deutsche Fassung Milch Zhlung somatischer Zellen Teil 1: Mikroskopisches Verfahren (Referenzverfahren) (ISO 13366-1:2008) Milk Enumeration of somatic cell
14、s Part 1: Microscopic method (Reference method) (ISO 13366-1:2008) Lait Dnombrement des cellules somatiques Partie 1: Mthode au microscope (Mthode de rfrence) (ISO 13366-1:2008) Diese Europische Norm wurde vom CEN am 3. Februar 2008 angenommen. Die CEN-Mitglieder sind gehalten, die CEN/CENELEC-Gesch
15、ftsordnung zu erfllen, in der die Bedingungen festgelegt sind, unter denendieser Europischen Norm ohne jede nderung der Status einer nationalen Norm zu geben ist. Auf dem letzten Stand befindliche Listendieser nationalen Normen mit ihren bibliographischen Angaben sind beim Management-Zentrum des CEN
16、 oder bei jedem CEN-Mitglied auf Anfrage erhltlich. Diese Europische Norm besteht in drei offiziellen Fassungen (Deutsch, Englisch, Franzsisch). Eine Fassung in einer anderen Sprache,die von einem CEN-Mitglied in eigener Verantwortung durch bersetzung in seine Landessprache gemacht und dem Managemen
17、t-Zentrum mitgeteilt worden ist, hat den gleichen Status wie die offiziellen Fassungen. CEN-Mitglieder sind die nationalen Normungsinstitute von Belgien, Bulgarien, Dnemark, Deutschland, Estland, Finnland, Frankreich,Griechenland, Irland, Island, Italien, Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta, den Nie
18、derlanden, Norwegen, sterreich, Polen, Portugal, Rumnien, Schweden, der Schweiz, der Slowakei, Slowenien, Spanien, der Tschechischen Republik, Ungarn, dem Vereinigten Knigreichund Zypern. EUROPISCHES KOMITEE FR NORMUNG EUROPEAN COMMITTEE FOR STANDARDIZATION COMIT EUROPEN DE NORMALISATIONManagement-Z
19、entrum: rue de Stassart, 36 B-1050 Brssel 2008 CEN Alle Rechte der Verwertung, gleich in welcher Form und in welchem Verfahren, sind weltweit den nationalen Mitgliedern von CEN vorbehalten.Ref. Nr. EN ISO 13366-1:2008 DEN ISO 13366-1:2008 (D) 2 Inhalt Seite Vorwort 3 1 Anwendungsbereich .4 2 Begriff
20、e .4 3 Kurzbeschreibung .4 4 Chemikalien4 4.1 Farblsungen .4 4.2 Phosphat-Pufferlsung (PBS) 6 5 Gerte7 6 Probenahme .7 7 Vorbereitung der Untersuchungsprobe 7 7.1 Lagerung.7 7.2 Vorbereitung.8 8 Durchfhrung.8 8.1 Vorbereitung des Ausstrichs und Frbung 8 8.2 Bestimmung .9 9 Berechnung und Darstellung
21、 der Ergebnisse . 13 9.1 Auszhlen einer rechteckigen Flche in aufeinander folgenden Feldern 13 9.2 Auszhlen einer rechteckigen Flche mit Streifen 14 9.3 Auszhlen einer kreisrunden Flche in aufeinander folgenden Feldern 14 9.4 Darstellung der Ergebnisse. 15 10 Przision 15 10.1 Wiederholprzision. 15 1
22、0.2 Vergleichprzision 15 11 Untersuchungsbericht . 16 Anhang A (informativ) Ringversuch. 17 Anhang B (informativ) Frben von Ziegenmilch . 18 Anhang C (informativ) Poisson-Verteilung 19 Literaturhinweise . 20 DIN EN ISO 13366-1:2008-06 EN ISO 13366-1:2008 (D) 3 Vorwort Dieses Dokument (EN ISO 13366-1
23、:2008) wurde vom Technischen Komitee ISO/TC 34 Food products“ in Zusammenarbeit mit dem Technischen Komitee CEN/TC 302 Milch und Milchprodukte Probenahme- und Untersuchungsverfahren“ erarbeitet, dessen Sekretariat vom NEN gehalten wird. Diese Europische Norm muss den Status einer nationalen Norm erh
24、alten, entweder durch Verffentlichung eines identischen Textes oder durch Anerkennung bis August 2008, und etwaige entgegenstehende nationale Normen mssen bis August 2008 zurckgezogen werden. Es wird auf die Mglichkeit hingewiesen, dass einige Texte dieses Dokuments Patentrechte berhren knnen. CEN u
25、nd/oder CENELEC sind nicht dafr verantwortlich, einige oder alle diesbezglichen Patentrechte zu identifizieren. Dieses Dokument ersetzt EN ISO 13366-1:1997. Entsprechend der CEN/CENELEC-Geschftsordnung sind die nationalen Normungsinstitute der folgenden Lnder gehalten, diese Europische Norm zu berne
26、hmen: Belgien, Bulgarien, Dnemark, Deutschland, Estland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta, Niederlande, Norwegen, sterreich, Polen, Portugal, Rumnien, Schweden, Schweiz, Slowakei, Slowenien, Spanien, Tschechische Republik, Ungarn, Verei
27、nigtes Knigreich und Zypern. Anerkennungsnotiz Der Text von ISO 13366-1:2008 wurde vom CEN als EN ISO 13366-1:2008 ohne irgendeine Abnderung genehmigt. DIN EN ISO 13366-1:2008-06 EN ISO 13366-1:2008 (D) 4 1 Anwendungsbereich Dieser Teil der ISO 13366|IDF 148 legt ein mikroskopisches Verfahren (Refer
28、enzverfahren) fr die Zhlung somatischer Zellen sowohl in roher als auch in chemisch konservierter Milch fest. Dieser Teil von ISO 13366|IDF 148 ist fr die Zhlung somatischer Zellen in Kuhmilch anwendbar, vorausgesetzt, dass die mglicherweise erwhnten Forderungen erfllt sind. Dieses Verfahren ist gee
29、ignet fr die Herstellung von genormten Untersuchungsproben und fr die Bestimmung von Werten fr das Referenzverfahren, die fr die Kalibrierung mechanisierter und automatisierter Zellzhlverfahren verwendet werden. WARNUNG Die Anwendung dieser Norm ist mglicherweise mit der Anwendung gefhrlicher Stoffe
30、, Verfahrensschritte und Ausrstungsgegenstnde verbunden. Die Norm kann jedoch nicht alle mit ihrer Anwendung verbundenen Sicherheitsprobleme anfhren. Es liegt in der Verantwortung des Anwenders dieser Norm, angemessene Sicherheits- und Gesundheitsvorkehrungen zu treffen und vor der Anwendung die Anw
31、endbarkeit einschrnkender Vorschriften zu bestimmen. 2 Begriffe Fr die Anwendung dieses Dokuments gilt der folgende Begriff. 2.1 somatische Zellen Zellen, einschlielich ihrer Kerne, dies bedeutet alle Leukozyten und Epithelzellen, die nach dem in diesem Teil von ISO 13366|IDF 148 beschriebenen Verfa
32、hren bestimmt werden 3 Kurzbeschreibung Eine Menge der zu untersuchenden Milchprobe wird auf einem Objekttrger dnn ausgestrichen, um einen Film auszubilden. Der Ausstrich wird getrocknet und gefrbt, und anschlieend werden die gefrbten Zellen unter einem Mikroskop gezhlt. Multiplikation der Anzahl de
33、r von einer festgelegten Flche ausgezhlten Zellen mit einem Arbeitsfaktor, woraus sich die Anzahl der Zellen je Milliliter ergibt. 4 Chemikalien Soweit nicht anders angegeben, sind nur analysenreine Chemikalien und destilliertes oder deionisiertes Wasser oder Wasser von entsprechender Reinheit zu ve
34、rwenden. 4.1 Farblsungen WARNUNG Tetrachlorethan ist giftig. Ethidiumbromid ist mutagen. Geeignete Handlungsweisen fr eine Deaktivierung im Falle von Verschtten mssen getroffen werden. Die Herstellung und Verwendung der Farblsung muss unter einem Abzug vorgenommen werden, dabei ist eine persnliche S
35、chutzausrstung zu verwenden. DIN EN ISO 13366-1:2008-06 EN ISO 13366-1:2008 (D) 5 4.1.1 Modifizierte Newman-Lampert-Farblsung (Levowitz-Weber-Modifikation) 4.1.1.1 Zusammensetzung Ethanol, 95 % (Volumenanteil) 54,0 ml Tetrachlorethana 40,0 ml Methylenblau 0,6 g Eisessig 6,0 ml aWahlweise kann Tetrac
36、hlorethan durch die angegebene gleiche Menge Xylol ersetzt werden. 4.1.1.2 Herstellung Das Ethanol und das Tetrachlorethan werden in eine Flasche gegeben und gemischt. Die Mischung wird in einem auf 65 C eingestellten Wasserbad (5.1) erwrmt. Das Methylenblau wird zugefgt und sorgfltig durchmischt. D
37、ie Mischung wird in einem Khlschrank auf 4 C abgekhlt. Dann wird der Eisessig zugefgt und nochmals durchmischt. Die entstandene Lsung wird durch einen geeigneten Filter (5.2) filtriert und in einer luftdicht verschlossenen Flasche aufbewahrt. Die Newman-Lampert-Farblsung wird vor Gebrauch nochmals f
38、iltriert. 4.1.2 Ethidiumbromid-Farblsung 4.1.2.1 Farb-Stammlsung 4.1.2.1.1 Zusammensetzung Ethidiumbromid 0,25 g demineralisiertes Wasser 100 ml 4.1.2.1.2 Herstellung Das Ethidiumbromid wird in auf 40 C vorgewrmten demineralisierten Wasser aufgelst. Die Lsung wird auf Raumtemperatur abgekhlt. Mit de
39、mineralisiertem Wasser wird auf 100 ml aufgefllt. Die Ethidiumbromid-Farbstammlsung kann maximal 2 Monate verwendet werden, wenn sie im Dunkeln bei 2 C 2 C aufbewahrt wird. 4.1.2.2 Pufferlsung 4.1.2.2.1 Zusammensetzung Kaliumhydrogenphthalat 0,51 g Kaliumhydroxid 0,162 demineralisiertes Wasser 100 m
40、l DIN EN ISO 13366-1:2008-06 EN ISO 13366-1:2008 (D) 6 4.1.2.2.2 Herstellung Das Kaliumhydrogenphthalat und das Kaliumhydroxid werden getrennt in dem demineralisierten Wasser gelst. Die Pufferlsung kann maximal 2 Monate verwendet werden, wenn sie im Dunkeln bei 2 C 2 C aufbewahrt wird. 4.1.2.3 Ethid
41、iumbromid-Farbarbeitslsung 4.1.2.3.1 Zusammensetzung Ethidiumbromid-Farbstammlsunga (4.1.2.1) 2 ml Pufferlsung (4.1.2.2) 8 ml Triton X-100 0,1 ml demineralisiertes Wasser 90 ml aEine hohe Temperatur kann die Frbungsfhigkeit des Ethidiumbromids verringern. 4.1.2.3.2 Herstellung Der Reihe nach werden
42、die Ethidiumbromid-Farbstammlsung, die Pufferlsung und das Triton X-100 in das demineralisierte Wasser gegeben und durchmischt. Die Ethidiumbromid-Farbarbeitslsung ist direkt, bevor sie verwendet wird, frisch herzustellen. 4.2 Phosphat-Pufferlsung (PBS) 4.2.1 Zusammensetzung NaCl 8 g KCl 0,2 Na2HPO4
43、 7 H2O 1,15 g KH2PO40,2 demineralisiertes Wasser 1 000 ml 4.2.2 Herstellung Die Salze werden in demineralisiertem Wasser gelst. Mit dem restlichen demineralisierten Wasser wird auf 1 000 ml aufgefllt. Der pH-Wert wird auf 7,2 0,1 eingestellt. ANMERKUNG Es kann auch eine handelsbliche Phosphat-Puffer
44、lsung mit einem pH-Wert = 7,2 verwendet werden. DIN EN ISO 13366-1:2008-06 EN ISO 13366-1:2008 (D) 7 5 Gerte bliche Laborgerte und besonders folgende: 5.1 Wasserbder, einstellbar auf die Temperaturen von 40 C 2 C, 50 C 2 C und 65 C 2 C. 5.2 Filter, bestndig gegen die verwendeten Lsemittel mit einer
45、Porengre von 10 m bis 12 m. 5.3 Mikroskop, mit 500- bis 1 000-facher Vergrerung. Objektive fr l-Immersion knnen verwendet werden. Falls Ethidiumbromid verwendet wird, muss das Mikroskop mit einer Fluoreszenzeinrichtung ausgestattet sein. 5.4 Mikrospritze, die ein Nennvolumen von 0,01 ml Milch aufneh
46、men kann, mit Grenzabweichungen von 2 %. 5.5 Mikrometer, zertifiziert. 5.6 Objekttrger, mit eingezeichnetem Strichfeld (rechteckig oder kreisrund), mit einer Flche von 1 cm2 5 % (95 mm2bis 105 mm2), oder ein Standardobjekttrger, mit einer Schablone von 20 mm 5 mm oder einem Durchmesser d von 11,28 m
47、m. 5.6.1 Auswahl der Objekttrger Mit einer festgelegten Flche oder einer Schablone zu arbeiten, ist vorzuziehen, um die Rckrechnung des Arbeitsfaktors bei jeder Zhlung zu vermeiden. 5.6.2 Strichfelder Bei einem rechteckigen Feld sollten die oberen und unteren Innenbreiten einerseits und die linken u
48、nd rechten Innenhhen andererseits um nicht mehr als 0,2 mm abweichen. Bei kreisrundem Feld sollten die vertikalen und horizontalen Innendurchmesser um nicht mehr als 0,2 mm abweichen. 6 Probenahme Dem Labor sollte eine reprsentative Probe zur Verfgung gestellt werden. Diese sollte whrend des Transpo
49、rts oder der Lagerung nicht beschdigt oder verndert worden sein. Die Probenahme ist kein Bestandteil des in diesem Teil von ISO 13366|IDF 148 festgelegten Verfahrens. Ein als geeignet zu empfehlendes Probenahmeverfahren ist in ISO 707|IDF 50 angegeben. Falls automatische Probenahmegerte verwendet werden, m
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