1、ICS 17.180.30N 33中华人民共和国国家标准GBT 18873-2002生物薄试样的透射电子显微镜一X射线能谱定量分析通则General specification of transmission electron microscope(TEM）-X-rayenergy dispersive spectrum(EDS) quantitative microanalysis forthin biological specimens2002一11一11发布2003一06一01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布GB/T 18873-2002前 J 蔺本标准的附录A是资料性附录
2、。本标准由全国微束分析标准化技术委员会提出。本标准由全国微束分析标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国人民解放军第二军医大学、中国人民解放军军事医学科学院、复旦大学医学院、上海市计量测试技术研究院。本标准主要起草人：杨勇骥、张德添、俞彰、张训彪。GB/T 18873-2002生物薄试样的透射电子显微镜一X射线能谱定量分析通则范围本标准规定了透射电子显微镜一X射线能谱仪定量分析生物薄试样的技术要求和规范。本标准适用于生物薄试样所含非超轻元素的定量分析。2术语和定义生物薄试样thin biological sample生物薄试样是指采用超薄切片机切成的、厚度为100 nm-300 nm的生物试
3、样。2.2生物薄标样thin biological standard specimen生物薄标样是指采用超薄切片机切成的、厚度为100 nm-300 nm的生物标准样品。2.3G因子（或平均加重权）G factor(or average aggravating weight)生物试样和生物标样的化学组成成分的元素因子。G因子可用下式计算得到：G一习C;Zi2/A,式中：C;薄试样或薄标样化学组成中元素i所占的质量分数；Z;为元素i的原子序数；A;为元素i的原子量。3基本原理用聚焦的高能电子束照射生物薄试样的微小区域，该区域中的元素受到高能电子束的激发产生特征X射线，其特征X射线能量对应于相关的
4、元素；特征X射线的强度对应于元素的浓度。采用能谱仪将接收到的特征X射线峰强度与背底强度（即连续X射线强度）之比（峰背比）与在相同条件下电子束照射生物薄标样中同种元素所获得的相应的X射线峰背比进行比较，确定被测生物薄试样激发区域内各元素的含量。4仪器和设备透射电子显微镜；X射线能谱仪；机械推进式超薄切片机。5生物薄标样的选择5.1生物薄标样的化学成分要尽可能地与被分析生物薄试样相似，且有化学成分定值。GB/T 18873-20025.2生物薄标样的厚度与被分析生物薄试样的厚度应相近，必须是采用机械推进式超薄切片机切成的厚度小于300 nm的生物薄标样。5.3生物薄标样所用的载网应是直径3 mm的
5、电子显微镜用标准载网，推荐使用碳载网、尼龙载网或金载网。5.45.5用于制备生物薄标样的基质材料，其G因子应接近于生物软组织的G因子3. 280标样应具有较高的抗电子辐射及抗污染的能力。6生物薄试样6.2生物薄试样的厚度应小于300 nm，必须是采用机械推进式超薄切片机切成的生物薄试样。生物薄试样所用的载网应是直径3 mm的电子显微镜用标准载网，推荐使用碳载网、尼龙载网或金载网。7准备工作7. 1电子显微镜系统7.1.1开机，抽真空至电子显微镜正常工作所需的高真空后再稳定30 min以上。7. 1.2选择测试薄标样所需的加速电压，检测生物薄试样所需的加速电压应选择在35 kV-75 kV之间。
6、7. 1.3调节电子枪的灯丝电流，使束流处于稳定饱和状态。7. 1.4对电子光学系统进行对中调整，使电子显微镜处于最佳工作状态。7. 1.5在定量分析过程中，不能再对电子光学系统进行对中调整。7. 1.6建议在冷阱中加人液氮，以提高真空度，减少样品污染。7.2能谱分析系统7.2. 1开机，一般预热30 min左右。7.2.2在不加电子显微镜加速电压的条件下，检测X射线能谱仪的本底计数率，本底计数率应小于60 cpsa7.2.3 X射线能谱仪的能量漂移范围在工作时间内应小于10 eV。如峰位漂移较大，可调节能谱仪中的零位调节系统，使峰位漂移小于10 eV 97.2.4校检脉冲处理器的状态，调节增
7、益，并使噪音信号尽可能减小。7. 2. 5定量分析前，必须校检能谱仪的分辨本领。用纯Cu,Co, Mn等标样检查Be窗探测器；用含F标样检查超薄窗探测器低能端的分辨本领。7.2.6检查所得结果，手动或自动输人到计算机中，以备定量分析时调用。注：如仪器有自动校正程序，则不需执行7.2.3和7. 2. 4,8选择仪器测f条件8. 1选择加速电压因大多数生物试样在高加速电压下极易受损，如使用透射电子显微镜对生物试样中常含的原子序数小于32的元素（如Na,Mg,P,S,CI,K,Ca等）进行测试时，推荐的加速电压值为35 kV-75 kV.8.2选择电子束束流在确定的加速电压下，选择电子束束流使X射线
8、的计数率在800 cps-3 000 cps o8.3选择电子束束斑直径8.3. 1保证电子束束斑产生的激发区尺寸不超过待分析区的尺寸，且被分析元素的特征X线的强度足够高（能达到预期的分析精度）。8.3.2推荐采用的电子束束斑直径：对生物薄试样检测分析可采用正聚焦，束斑直径小于1 AM。如欲GB/T 18873-2002测量较大区域的元素成分，可采用相应的散焦束斑。如欲测量较小区域的元素成分，也可采用直径更小的电子束束斑。8.4选择被分析元素的X线系8.4. 1被分析元素的原子序数Z成32时，采用K线系；8.4.2被分析元素的原子序数72Z32时，采用L线系；8.4.3被分析元素的原子序数Z7
9、2时，采用M线系。8.4.4选择不受重叠峰和逃逸峰重叠的谱线，在确定有峰重叠时应认真作谱峰剥离。8.5选择能谱仪收谱计数时间能谱仪收谱计数时间一般为100 s。在测量低浓度含量元素并有精度要求时，应适当延长计数时间，并满足以下公式要求：N,厂Nb）3 (N, )/2式中：N,该元素谱峰处计数；Nb本底处计数。9测盘分析步骤9.1确定分析部位9.1.1在透射电子显微镜或扫描透射电子显微镜中寻找试样的分析部位，确定后将分析部位置于电子显微镜的观察中心。9.1.2使电子束聚焦，并保持图像清晰，调整电子束束斑到观察荧光屏的中心位置上，并使分析部位置于荧光屏的中心位置上。在寻找标样和试样时只能移动X,Y
10、轴，不能调整电子光学系统（包括物镜聚焦）。9.2定性分析选用适当的加速电压和计数时间，收谱后采用峰鉴别检查试样中所含元素的种类。9.3建立标准样品数据库根据定性分析结果，建立或调用相应的标准样品的数据文件。建立被分析样品的文件清单（元素、价态、线系、测量条件、处理模式）等。9.3.1在完全一致的测量条件下（束流、加速电压、计数时间、放大器的增益、束斑大小及检出角）收集标准样品的X射线谱线，并可根据不同类型的试样建立不同类型的标样数据库。如测量条件发生变化，应建立新的标样数据库。9.3.2在对试样定量分析前，应调用相应程序测量有关标准样品，其分析结果的误差应小于允许误差。9.4定璧分析9.4.1
11、根据试样的特征，采用完全一致的测量条件及调入生物X射线能谱定量分析程序，建立分析试样所需的标准样品数据文件。9.4.2选用与已建立的标样数据库完全一致的测量条件进行谱的收集。9.4.3重叠谱峰剥离。如有谱线重叠时，利用能谱仪的计算机程序进行重叠峰的剥离。必要时应使用成分相近的标样进行验证。9.4.4本底测量。用设置两个本底窗口的方法进行本底扣除，这时应将本底窗口设置在感兴趣元素谱峰的近侧，如感兴趣元素较多，应尽可能将本底窗口分别设置在感兴趣元素谱峰的高、低能量段处。或用手动本底划线法扣除本底。9.4.5计算各元素的特征X射线相应强度比，并计算出试样中各元素的相应含量。10误差10.1误差计算公
12、式GB/T 18873-2002在发布分析结果时，必须同时给出生物薄试样定量分析的相对误差值，其相对误差值的计算公式如下：。002 518 X Cbntv L式中：Cb为标样元素浓度；C.为试样元素浓度；n为测量次数；N为扣除本底的被测元素的计数平均值。10.2为减小相对误差值，建议选取浓度值较低的标样作为测试用标样。11分析结果的发布11. 1定量分析结果的报告应包括以下信息：a)分析报告的唯一编号；b)分析报告的页码；c)分析报告的日期；d)实验室名称和地址；e)送样人姓名，单位和地址；f)样品的接收日期；g）样品原编号，分析编号及样品特征的描述；h)分析所依据的标准方法；i)选用标准样品
13、的种类、级别、浓度、G因子；1）分析结果和必要的相对误差值；k)分析仪器及其工作条件，所用标样等；D分析报告负责人的签字。11.2生物薄试样内非超轻元素的能谱探测极限约在0. 1 mmol/kg左右，对低于0. 1 mmol/kg浓度的元素定量分析值应有分析方法的补充说明。GB/T 18873-2002附录A（资料性附录）生物组织G因子计算法A. 1导言本附录给出了生物组织、生物标样G因子的计算方法。并已计算出了透射电子显微镜一X射线能谱仪常用生物软组织的G因子。A. 2生物组织的G因子计算生物软组织的G因子计算法如下：G一ZZ /A二艺C,Z,Z/A;。(A. 1）式中：Z-元素的原子序数；
14、A元素的原子量；C;薄试样或薄标样化学组成中元素2所占的质量分数；Z; ,A;分别为元素2的原子序数与原子量。A. 3生物软组织的G因子计算生物软组织的元素、所占质量分数及计算结果如表A. 1:表A. 1生物软组织的元素、所占质童分数及计算结果元素质量分数矛AZ2 /ACZ; z /A;H0.071110.07C0.05361231.50N0.164914350. 56O0.25641641.00S+ P0.0224031.57.70. 15Z2 /A二MC; Z; 2 JA3.28A. 4生物软组织的G因子由表A. 1，生物软组织的G因子为3.28.GB/T 18873-2002参考文献12
15、34S6Hutchinson TE. Microprobe analysis of biological systems. New York, Academic Press. 1981Hall TA, Anderson HC, Appleton T. The use of thin specimens for X-ray microanalysis in biology.J Microsc,1973，99：177杨勇骥，郑尊，夏愿耀建立一种新型Agarose薄标样一应用于生物EDX定量分析第二军医大学学报1991,12:67Chandler JA. A method for preparing
16、 absolute standards for quantitative calibration and measure-ment of section thickness with X-ray microanalysis of biological ultrathin specimens in EMMA. JMicrosc. 1976，106：291Shuman H，Somlyo AV, Somlyo AP. Quantitative electron probe microanalysis of biological thinsection:methods and validity. Ultramicroscopy. 1976，1:317Harvey DMR, Flowers TJ, Kent B. Improvement of quantitative of biological X-ray microanalysis. JMicrosc. 1984，143:249
