1、第2讲 微生物的培养与应用 酶的应用,-2-,1.微生物的分离和培养。 2.某种微生物数量的测定。 3.培养基对微生物的选择作用。 4.酶活力测定的一般原理和方法。 5.酶在食品制造和洗涤等方面的应用。 6.制备和应用固相化酶。,-3-,核心梳理,提能探究,考向感悟,归纳总结,微生物的分离与培养 1.培养基 (1)概念:人们按照微生物对 营养物质 的不同需求,配制出供其 生长繁殖 的营养基质。 (2)营养组成:一般都含有 水、碳源、氮源 和无机盐,还需要满足微生物生长对pH、氧气以及 特殊营养物质 的要求。,教材深挖平板冷凝后,为什么要将平板倒置? 提示:平板冷凝后,皿盖上会凝结水珠,凝固后的
2、培养基表面的湿度也比较高,将平板倒置,既可以使培养基表面的水分更好地挥发,又可以防止皿盖上的水珠落入培养基,造成污染。,-4-,核心梳理,提能探究,考向感悟,归纳总结,2.无菌技术 (1)关键:防止 外来杂菌 的入侵。 (2)无菌操作的方法,-5-,核心梳理,提能探究,考向感悟,归纳总结,3.大肠杆菌的纯化培养 (1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,(2)纯化大肠杆菌 纯化培养原理:在培养基上将细菌稀释或分散成 单个细胞 ,使其长成单个的菌落,这个菌落就是一个纯化的细菌菌落。 菌落:由 一个细胞 繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。 常用的微生物接种方法 a.平板划线法:通过 接种环 在琼脂固体培养基
3、表面 连续划线 的操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。 b. 稀释涂布平板 法:将菌液进行一系列的 梯度稀释 ,然后将 不同稀释度 的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面,进行培养。,-6-,核心梳理,提能探究,考向感悟,归纳总结,(3)菌种的保藏方法 对于频繁使用的菌种,可以采用 临时保藏 的方法。 对于需要长期保存的菌种,可以采用 甘油管藏 的方法。,-7-,核心梳理,提能探究,考向感悟,归纳总结,(1)培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。( ) (2)在配制培养基时,除满足营养需求外,还应考虑微生物对pH、O2及特殊营养物质的需求。( ) (3)培养基分装到培养皿后才能进行灭
4、菌。( ) (4)消毒的原则是既能杀死材料表面的微生物,又要减少消毒剂对细胞的伤害。( ) (5)无菌操作的对象只要是没有生物活性的材料(如培养基、接种环等)都可采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。 ( ) (6)平板划线法中每一次划线后要将接种环灼烧。 ( ) (7)用稀释涂布平板法纯化大肠杆菌时,只要稀释度足够高,就能在培养基表面形成单个菌落。( ),-8-,核心梳理,提能探究,考向感悟,归纳总结,右上图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图,请思考下列问题。(1)获得图A效果和图B效果的接种方法分别是什么? 提示:获得图A效果的接种方法为稀释涂布平板法,获得图B效果的接种方法为平板
5、划线法。 (2)某同学在纯化土壤中的某种细菌时,发现培养基上的菌落连成了一片,最可能的原因是什么?应当怎样操作才可避免此种现象? 提示:最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在每次划线后未将接种环灼烧灭菌;采取的措施是增大稀释倍数或每次划线后将接种环灼烧灭菌。,-9-,核心梳理,提能探究,考向感悟,归纳总结,考向 微生物的纯化技术 (2018全国卷)将马铃薯去皮切块,加水煮沸一定时间,过滤得到马铃薯浸出液。在马铃薯浸出液中加入一定量蔗糖和琼脂,用水定容后灭菌,得到M培养基。 回答下列问题。 (1)M培养基若用于真菌的筛选,则培养基中应加入链霉素以抑制 的生长,加入了链霉素的培养基属于 培养基。 (
6、2)M培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质,营养物质类型除氮源外还有 (答出两点即可)。氮源进入细胞后,可参与合成的生物大分子有 (答出两点即可)。,-10-,核心梳理,提能探究,考向感悟,归纳总结,(3)若在M培养基中用淀粉取代蔗糖,接种土壤滤液并培养,平板上长出菌落后可通过加入显色剂筛选出能产淀粉酶的微生物。加入的显色剂是 ,该方法能筛选出产淀粉酶微生物的原理是 。 (4)甲、乙两名同学用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中微生物的数量,在同一稀释倍数下得到以下结果: 甲同学涂布了3个平板,统计的菌落数分别是110、140和149,取平均值133。 乙同学涂布了3个平板,统计的
7、菌落数分别是27、169和176,取平均值124。 有人认为这两名同学的结果中,乙同学的结果可信度低,其原因是 。,-11-,核心梳理,提能探究,考向感悟,归纳总结,答案:(1)细菌 选择 (2)碳源、无机盐 蛋白质、核酸 (3)碘液 淀粉遇碘液显蓝色,产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解,形成透明圈 (4)乙同学的结果中,1个平板的计数结果与另2个相差较大,结果的重复性差,-12-,核心梳理,提能探究,考向感悟,归纳总结,解析:(1)链霉素可抑制细菌的生存,但真菌可以在含链霉素的培养基中生存,所以加入链霉素的培养基可用于筛选出真菌,属于选择培养基。 (2)培养基中的营养物质主要有碳源、氮源、水和无机
8、盐等。蛋白质和核酸都含氮元素,所以氮源进入细胞后可用于合成蛋白质和核酸等大分子物质。 (3)检测淀粉所用的试剂是碘液,淀粉遇碘变蓝。如果某种微生物产生了淀粉酶,则在其菌落周围就没有淀粉存在,不再呈现蓝色,而是出现透明圈。 (4)计数时一般选择菌落数在30300的平板进行计数。乙同学的实验中,1个平板的计数结果与另2个相差较大,可信度低。,-13-,核心梳理,提能探究,考向感悟,归纳总结,1.消毒和灭菌的比较,-14-,核心梳理,提能探究,考向感悟,归纳总结,2.两种微生物接种方法优缺点的比较,-15-,核心梳理,提能探究,考向感悟,归纳总结,微生物的筛选和计数 1.土壤中分解尿素的细菌的分离与
9、计数,-16-,核心梳理,提能探究,考向感悟,归纳总结,2.分解纤维素的微生物的分离 (1)纤维素酶 组成:纤维素酶是一种 复合酶 ,一般认为它至少包括三种组分,即 C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶 。,(2)纤维素分解菌的筛选 原理纤维素分解菌,-17-,核心梳理,提能探究,考向感悟,归纳总结,筛选方法: 刚果红 染色法,即通过是否产生 透明圈 来筛选纤维素分解菌。 培养基:以 纤维素 为唯一碳源的选择培养基。 实验流程 土壤取样:富含 纤维素 的环境 选择培养:用 选择培养基 培养,以增加纤维素分解菌的浓度 梯度稀释 :制备系列稀释液 涂布平板:将样品涂布到 鉴别纤维素分解菌 的培养基上 挑选产
10、生 透明圈 的菌落,-18-,核心梳理,提能探究,考向感悟,归纳总结,教材深挖为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物? 提示:在选择培养的条件下,那些能够适应这种营养条件的微生物迅速繁殖,而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制,因此选择培养可以起到“浓缩”的作用。,-19-,核心梳理,提能探究,考向感悟,归纳总结,(1)选择培养基可以鉴定某种微生物的种类。( ) (2)只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。( ) (3)筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中,尿素是唯一的氮源。( ) (4)分解尿素的细菌在分解尿素时,可以将尿素转化为氨,使得培养基的pH降低。( ) (5)在以尿素为唯一氮源
11、的培养基中加入酚红指示剂,若指示剂变蓝,则说明筛选到分解尿素的细菌。( ) (6)纤维素是构成植物细胞壁的主要成分,在纤维素酶的作用下,纤维素可以水解成葡萄糖。( ) (7)在筛选能分解纤维素的细菌的实验中,选择培养的目的是增大样品中目的菌株的浓度。( ),-20-,核心梳理,提能探究,考向感悟,归纳总结,(8)刚果红可以与纤维素形成透明复合物,所以可通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。( ) (9)刚果红染色法只能在培养微生物的时候加入刚果红。( ),-21-,核心梳理,提能探究,考向感悟,归纳总结,1.一些微生物可以有效地分解石油,如何配制选择培养基将这类微生物从含多种微生物的样品中选择
12、出来? 提示:配制的选择培养基中,以石油为唯一碳源,然后用这种培养基培养含多种微生物的样品,能在该种培养基上生存的就是能分解石油的微生物。 2.为什么测定活菌的数量不能用平板划线法? 提示:用平板划线法接种时,一般只在最后一次划线的末端形成只由一个活菌形成的菌落,而其他一些菌落往往由两个活菌或多个活菌繁殖而成,还有一些不能形成菌落,而在计数时一个菌落对应着一个活菌,这样在划线所得的平板中,菌落数目低于活菌的实际数值,所以不能用平板划线法测定活菌数量。,-22-,核心梳理,提能探究,考向感悟,归纳总结,考向1 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 1.(2016四川卷)图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的
13、过程,图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列。,-23-,核心梳理,提能探究,考向感悟,归纳总结,(1)图中选择培养基应以 为唯一氮源;鉴别培养基还需添加 作指示剂,产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后,其菌落周围的指示剂将变成 色。 (2)在5个细菌培养基平板上,均接种稀释倍数为105的土壤样品溶液0.1 mL,培养一段时间后,平板上长出的细菌菌落数目分别为13、156、462、178和191。 该过程采取的接种方法是 ,每克土壤样品中的细菌数量为 108个;与血细胞计数板计数法相比,此计数方法测得的细菌数较 。 (3)现有一菌株的脲酶由于基因突变而失活,突变后基因转录的mRNA在图乙箭头所示
14、位置增加了70个核苷酸,使图乙序列中出现终止密码(终止密码有UAG、UGA和UAA)。突变基因转录的mRNA中,终止密码为 ,突变基因表达的蛋白含 个氨基酸。,-24-,核心梳理,提能探究,考向感悟,归纳总结,答案:(1)尿素 酚红 红 (2)稀释涂布平板法 1.75 少 (3)UGA 115,-25-,核心梳理,提能探究,考向感悟,归纳总结,解析:(1)脲酶能够催化尿素分解为氨,故图中选择培养基应以尿素作为唯一氮源。由于尿素被分解成了氨,氨会使培养基的碱性增强,pH升高,使酚红指示剂变红色,故用酚红作为指示剂。 (2)本题用于计数细菌菌落数的接种方法是稀释涂布平板法,统计的菌落数应介于303
15、00之间,故应选择细菌菌落数为156、178和191的平板计数,每克土壤样品中的细菌数量为(156+178+191)/30.1105=1.75108(个)。由于两个或多个细菌连接在一起时,往往统计的是一个菌落,故用此方法测得的细菌数偏小。 (3)密码子由mRNA上3个相邻的碱基组成,271个碱基和后面2个碱基一起共组成91个密码子,插入的70个核糖核苷酸和后面2个碱基一起共构成24个密码子,后面的UGA是终止密码,故翻译产生的蛋白质含115个氨基酸。,-26-,核心梳理,提能探究,考向感悟,归纳总结,考向2 分解纤维素的微生物的分离 2.为获得果胶酶高产菌株,科研人员进行了下列分离、筛选、鉴定
16、工作。 (1)为分离果胶酶高产菌株,科研人员配制了下表所示成分的培养基,该表空白处的两种成分分别是 、 。制备的培养基常用 法进行灭菌。,(2)科研人员将采集的果园土壤放入无菌水中,振荡混匀,制成悬液。为获得较均匀分布的单菌落,还需要将悬液进行 ,用 法接种于固体培养基上。接种后的培养基呈 状态放入培养箱。,-27-,核心梳理,提能探究,考向感悟,归纳总结,(3)选择单菌落数目适宜的培养基,加入一定浓度的刚果红溶液(果胶与刚果红结合后显红色),一段时间后洗去培养基表面的刚果红溶液,观察并比较菌落和 直径的比值,筛选果胶酶高产菌株。 (4)将获得的菌株进行液体培养后,从培养液的 (填“上清液”或
17、“沉淀物”)获得粗提的果胶酶。将一定量的粗提果胶酶与适量果胶溶液混合,一定时间后测定吸光值来测定酶活性。进行吸光值测定时,需将 与等量果胶溶液混合,作为实验的对照。,答案:(1)果胶 蒸馏水 高压蒸汽灭菌 (2)梯度稀释(或系列稀释) (稀释)涂布平板 倒置 (3)透明圈 (4)上清液 等量失活的粗提果胶酶,-28-,核心梳理,提能探究,考向感悟,归纳总结,两种微生物筛选方法的比较,-29-,核心梳理,提能探究,考向感悟,归纳总结,酶的应用 1.果胶酶在果汁生产中的作用 (1)果胶酶不特指一种酶,而是一类酶的总称,包括 多聚半乳糖醛酸酶 、 果胶分解酶 和果胶酯酶等。 (2)果胶酶可以分解果胶
18、,使 榨取果汁 变得更容易;果胶分解后,也使得浑浊的果汁变得 澄清 。,-30-,核心梳理,提能探究,考向感悟,归纳总结,2.探讨加酶洗衣粉的洗涤效果 (1)加酶洗衣粉中常用的酶制剂包括 蛋白酶 、脂肪酶、 淀粉酶 和纤维素酶四种,这些酶的活性受温度、 酸碱度 和表面活性剂等的影响。 (2)加酶洗衣粉去污机理:碱性蛋白酶能将血渍、奶渍等含有的大分子 蛋白质 水解成可溶性的 氨基酸 或小分子的肽,脂肪酶、 淀粉酶 和纤维素酶也能分别把大分子 脂肪 、淀粉和 纤维素 水解为小分子物质,使污迹容易从衣物上脱落。,-31-,核心梳理,提能探究,考向感悟,归纳总结,3.酵母细胞的固定化 (1)固定化酶的
19、应用实例果糖生产:将果糖生产中所用的 葡萄糖异构酶 进行固定,可以连续使用该酶,降低了生产成本,提高了产品质量和生产效率。 (2)固定化酶和固定化细胞技术:指利用 物理或化学 方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术,包括包埋法、 化学结合法 和 物理吸附法 ,其中包埋法常用来固定 细胞 。 (3)制备固定化酵母细胞的操作: 酵母细胞的活化 配制CaCl2溶液配制 海藻酸钠 溶液 海藻酸钠 溶液与酵母细胞混合固定化酵母细胞。,-32-,核心梳理,提能探究,考向感悟,归纳总结,(1)果胶酶能将乳糖醛酸分解成半乳糖醛酸。( ) (2)果胶酶只改变果胶分解的速度,反应前后果胶酶本身没有发生改变。( )
20、(3)加酶洗衣粉的效果总比普通洗衣粉的效果好。( ) (4)从酶的固定方式看,物理吸附法比化学结合法对酶活性影响小。( ),-33-,核心梳理,提能探究,考向感悟,归纳总结,小华同学想用含有蛋白酶的洗衣粉洗涤妈妈送给她的真丝围巾,你认为她这样做合适吗?为什么? 提示:不合适。因为丝绸的主要成分是蛋白质,蛋白质会被洗衣粉中的蛋白酶分解,从而使真丝围巾损坏。,-34-,核心梳理,提能探究,考向感悟,归纳总结,考向 1 酶的活性测定及其应用 1.果胶酶能分解果胶等物质,可以用来澄清果蔬饮料,在食品加工业中有着广泛的应用。回答下列问题。 (1)果胶酶是分解果胶的酶的总称,包括 、果胶分解酶和 。食品工
21、业中之所以使用果胶酶澄清果蔬饮料,是因为果胶酶能破坏植物的 结构。 (2)微生物是生产果胶酶的优良生物资源。分离和筛选能产生果胶酶的微生物,使用的培养基应该以 为唯一碳源;为了纯化该生物,需要在 (填“固体”或“液体”)培养基上接种菌种,最常用的接种方法有 。 (3)在榨取果汁前,要将果胶酶和果泥混匀保温,目的是提高出汁率;过滤后要用果胶酶处理果汁,目的是 。,-35-,核心梳理,提能探究,考向感悟,归纳总结,(4)根据下表实验结果, (填“能”或“不能”)确定40 就是果胶酶的最适温度。,答案:(1)多聚半乳糖醛酸酶 果胶酯酶 细胞壁 (2)果胶 固体 平板划线法和稀释涂布平板法 (3)使果
22、汁变澄清 (4)不能,-36-,核心梳理,提能探究,考向感悟,归纳总结,考向2 固定化酶或细胞的制备和应用 2.乳糖酶能够催化乳糖水解为葡萄糖和半乳糖,具有重要应用价值。乳糖酶的制备及固定化步骤如下。,(1)筛选产乳糖酶的微生物L时,宜用 作为培养基中的唯一碳源。培养基中琼脂的作用是 。从功能上讲,这种培养基属于 。 (2)培养微生物L前,宜采用 方法对接种环进行灭菌。 (3)乳糖酶宜采用化学结合法(共价键结合法)进行固定化,可通过检测固定化乳糖酶的 确定其应用价值。除化学结合法外,酶的固定化方法还包括 、 等。,-37-,核心梳理,提能探究,考向感悟,归纳总结,答案:(1)乳糖 凝固剂 选择
23、培养基 (2)灼烧 (3)(酶)活性或(酶)活力 包埋法 物理吸附法(注:后面两空可颠倒) 解析:(1)在只有乳糖的培养基上,产生乳糖酶的微生物才能生存,从而筛选出产生乳糖酶的微生物,这类培养基属于选择培养基。 (2)接种微生物之前,对接种环要灼烧灭菌。 (3)获取酶后要检测其活性(活力)大小,活性(活力)大的酶才能用于生产。酶的固定方法包括化学结合法、包埋法、物理吸附法等。,-38-,核心梳理,提能探究,考向感悟,归纳总结,1.果胶酶与纤维素酶的比较,2.普通洗衣粉和加酶洗衣粉去污原理的异同,-39-,通关记,通关辨,通关练,1.无菌操作技术包括消毒和灭菌。消毒包括煮沸消毒、巴氏消毒、化学药
24、剂消毒和紫外线消毒等;灭菌包括灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌。 2.培养基的制备包括计算、称量、溶化、灭菌、倒平板等步骤。平板冷却凝固后,倒置平板的目的是防止培养皿盖上的水滴滴入培养基造成污染。 3.纯化大肠杆菌常用的接种方法包括平板划线法和稀释涂布平板法。平板划线法要求多次划线,稀释涂布平板法要求菌液要充分地稀释。 4.微生物计数时每个稀释度要制作多个平板,并选择菌落数为30300个的平板计数。,-40-,通关记,通关辨,通关练,5.尿素分解菌和纤维素分解菌的分离都运用了选择培养基,前者所用的培养基中尿素是唯一的氮源,后者所用的培养基中纤维素是唯一的碳源。 6.果胶酶不是特指某一种酶,而是
25、分解果胶的一类酶的总称;果胶酶的化学本质是蛋白质,能被蛋白酶水解;果胶酶具有酶的通性:只改变反应速度,不改变反应的平衡点。 7.加酶洗衣粉中的酶通常是通过基因工程生产的,能够耐酸、耐碱、忍受表面活性剂和较高温度。 8.添加了碱性蛋白酶的洗衣粉可以分解人体皮肤表面的蛋白质,使人患过敏性皮炎、湿疹等,因此,应避免与这类洗衣粉长时间地接触。,-41-,通关记,通关辨,通关练,9.固定化酶和固定化细胞的方法包括包埋法、化学结合法和物理吸附法。一般来说,酶更适合采用化学结合法和物理吸附法固定化,而细胞多采用包埋法固定化。,-42-,通关记,通关辨,通关练,1.选择培养基的选择方法 (1)在培养基中加入某
26、种化学物质。例如,加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌;加入高浓度的食盐可以分离出金黄色葡萄球菌。这里的加入是在主要营养成分完整的基础上加入。 (2)改变培养基中的营养成分。例如,缺乏氮源时可以分离出固氮微生物;石油作为唯一碳源时,可以分离出能分解石油的微生物。 (3)改变微生物的培养条件。例如,将培养基放在高温环境下培养,可以分离出耐高温的微生物。 2.果胶酶和纤维素酶的作用辨析 (1)两种酶都是复合酶,是催化几个连续反应的几种不同的酶的总称,不是特指一种酶。 (2)两种酶都是水解酶,可同时发挥作用,不会相互干扰,制作果汁过程中可同时加入。,-43-,通关记,通关辨,通关练,(2017江苏卷)苯
27、酚及其衍生物广泛存在于工业废水中,对环境有严重危害。小明同学准备依据下图操作步骤,从处理废水的活性污泥中分离筛选酚降解高效菌株。请回答下列问题。,(1)酚降解菌富集培养基含有蛋白胨、K2HPO4、MgSO4、苯酚和水,其中可作为碳源的有 。 (2)将采集到的样品接种培养,苯酚用量应随转接次数的增加而逐渐 ,以达到富集酚降解菌的目的。若上图平板中菌落过于密集,应进一步 ,以便于菌落计数与分离。制备平板培养基时除了需要水、营养物质外,还必须添加 。,-44-,通关记,通关辨,通关练,(3)下图为连续划线法示意图,在图中 (填图中序号)区域更易获得单菌落。,-45-,通关记,通关辨,通关练,(4)采
28、用比色测定法(使用苯酚显色剂)检测降解后的废水中苯酚残留量。先制作系列浓度梯度并进行显色反应,下表中15号比色管的苯酚浓度应分别为 。 如果废水为50 mg/L 的苯酚溶液,降解后约有21%的苯酚残留,则需将残留液稀释 (填序号:5 10 20)倍后,再进行比色。,答案:(1)蛋白胨、苯酚 (2)增加 稀释涂布 凝固剂 (3) (4)0、0.2、0.4、0.6、0.8 ,-46-,通关记,通关辨,通关练,解析:(1)培养基中的营养物质一般都包括水、无机盐、碳源、氮源,蛋白胨和苯酚中含有C元素,可作为碳源。 (2)要富集该菌,应提高营养物质含量。若菌落过于密集,说明稀释倍数不够,应进一步稀释,然
29、后再涂布平板。制备固体培养基时需加入凝固剂琼脂。 (3)用平板划线法接种菌体,随划线次数的增加,菌体数量逐渐减少,故区域更易获得单菌落。,-47-,通关记,通关辨,通关练,(4)题中已给出6号比色管中的苯酚浓度为1 mg/L,根据浓度梯度的设计原则和空白对照原则,15号比色管中的苯酚浓度应依次为0 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L、0.8 mg/L。废水中苯酚的浓度为50 mg/L,降解后约有21%的苯酚残留,则降解后废水中苯酚的浓度为5021%=10.5(mg/L),因为比色管中苯酚的浓度范围为01 mg/L,若将降解后的废水稀释5倍或10倍,则稀释后废水中苯酚的浓度均大于1 mg/L,若稀释20倍,则稀释后废水中苯酚的浓度为0.525 mg/L,介于01 mg/L之间,故需将降解后的废水稀释20倍后再进行比色。,
