1、第30讲 微生物的利用,一、微生物的实验室培养 1.培养基 (1)概念:人们按照微生物对营养物质的不同需求,配制出供其生长繁殖 的营养基质。 (2)成分:一般都含有碳源、 氮源 、水和无机盐,还需要满足不同 微生物生长对 pH 、特殊营养物质以及氧气的要求。,教材研读,2.无菌技术 方法,3.实验操作 牛肉膏蛋白胨固体培养基的制备: 计算称量溶化调节pH灭菌 倒平板 。,二、细菌的分离方法:划线分离法和涂布分离法 1.划线分离法 (1)方法:用接种环蘸菌液后在含有 固体 培养基的培养皿平板上 划线,使聚集的菌种分散到培养基的表面。经培养,可看到在划线的末 端出现不连续的 单个菌落 ,表明菌已被
2、分离。在无菌操作下将单 菌落接种到斜面上,每个斜面的 菌落 就是一个细菌产生的后代。 (2)应用:用于基因工程的大肠杆菌等工程菌,可以用 划线分离法 获得产物表达能力高的菌株。由于工程菌的质粒中通常有 抗性基,因 (如抗氨苄青霉素基因),如在培养基中加入一定量的氨苄青霉素,由于非工程菌和其他杂菌都没有抗性基因,所以在划线后只有存在抗性基 因的工程菌能生存下来。,2.涂布分离法:先将培养的菌液 稀释 ,通常稀释到10-710-5倍,然后 取0.1 mL稀释度不同的稀释菌液加在培养皿的 固体培养基 上,用 玻璃刮刀 涂布在培养基平面上进行培养,在适当的稀释度下,可 产生相互分开的 菌落 。,3.二
3、者比较:划线分离法,方法 简单 ;涂布分离法,单菌落更易分开, 但操作 复杂 。,三、大肠杆菌的培养和分离 1.大肠杆菌的特点:革兰氏 阴性 、兼性厌氧的肠道杆菌。 2.细菌的繁殖:以 分裂 的方式繁殖,分裂速度很快。 3.细菌的扩大培养:用 LB液体 培养基,划线分离用 LB固体平 面 培养基。,4.大肠杆菌的分离操作技术 最常用的方法是划线分离法,其操作步骤是: (1)培养基灭菌:将刚配制好的50 mL LB液体培养基和50 mL LB固体培 养基分别装入两个250 mL的三角瓶中,加上封口膜,用 高压锅 进 行灭菌。 (2)倒平板:在 酒精灯火焰 旁将固体培养基分别倒在4个培养皿中, 使
4、培养基铺平皿底部,待凝,使之形成平面。 (3)接种扩大培养:靠近酒精灯火焰将大肠杆菌接种到三角瓶的 液,体培养基 中,三角瓶在 37 ,每分钟200转的摇床中振荡培养12 h。 (4)划线分离:将摇床上培养12 h的菌液在固体培养基的平板上 连续 划线 ,然后将盖好的培养皿 倒置 ,放在37 恒温培养箱中进行 培养,1224 h后,可看到在划线的末端出现不连续的 单个菌落 ,表 明菌已被分离。 (5)菌种保存:在无菌操作下将单菌落用接种环取出,再用 划线 法 接种在空白斜面上,在37 下培养24 h后,置于 4 冰箱中保存。,四、分离以尿素为氮源的微生物 1.实验原理:不同微生物利用氮源种类
5、不同 。有一些细菌含有 脲 酶,通过降解尿素作为其生长的氮源。尿素在脲酶的降解下产生 NH3 ,使培养基的pH由原来的 中性 变为 碱性 ,于是 培养基中的酚红由红黄色变成 红色 。,2.实验步骤: (1)制备培养基:在60 左右时,将两个三角瓶中已灭菌的LB固体培养基 和 尿素 固体培养基,在酒精灯旁分别倒入两个培养皿中,摇匀后 平放至凝固。 (2)制备细菌悬液:在 无菌 条件下,将土样1 g加到有99 mL无菌水 的三角瓶中,振荡10 min,即成10-2土壤稀释液,依此方法制备出10-3、10-4 和10-5的土壤稀释液。,(3)涂布法分离:取0.1 mL稀释10-4和10-5的土壤稀释
6、液,分别加到有LB培 养基和尿素培养基的培养皿中,用 灼烧法 灭菌的玻璃刮刀将菌液 涂布到整个平面上。 (4)培养和观察:在37 恒温箱中培养2448 h,观察 菌落数 。,3.预测本实验的结果:LB全营养固体培养基上的菌落 多而杂 ;尿 素固体培养基上的菌落 少而纯 ,一定时间内,菌落周围出现 红色 区域。用浓度为10-4和10-5土壤稀释液接种,更容易形成单菌落的 是 10-5 土壤稀释液。,1.下列有关划线分离法的操作错误的是 ( D ) A.将接种环放在火焰上灼烧 B.将已冷却的接种环伸入菌液中只蘸取一次 C.蘸取菌液和划线要在火焰旁进行 D.划线时要将最后一区的划线与第一区的划线相连
7、,解析 划线前,接种环需放在酒精灯火焰上灼烧灭菌;待接种环冷却 后伸入菌液中蘸取菌液一次;蘸取菌液和划线过程都要防止空气中杂菌 污染,要在酒精灯火焰旁进行;划线时不能将最后一区的划线与第一区 的划线相连,否则无法分离得到单菌落。,2.为探究适宜环境下,固定容积的培养液中酵母菌种群数量变化规律,研 究者进行了相关实验。下列叙述错误的是 ( D ) A.利用血细胞计数板计数时需要振荡均匀后取样 B.生长旺盛期的培养液上层比下层酵母菌数量多 C.涂布分离法计数可用接种等量无菌水组作对照 D.涂布分离法统计的酵母菌数目会比实际值略大,解析 探究培养液中酵母菌种群数量变化规律实验中,利用血细胞 计数板计
8、数时需要振荡均匀后取样,A正确;酵母菌通过需氧呼吸大量繁 殖,因此生长旺盛期的培养液上层比下层酵母菌数量多,B正确;涂布分 离法计数可用接种等量无菌水组作对照,C正确;由于酵母菌会相互重 叠,因此涂布分离法统计的酵母菌数目会比实际值略小,D错误。,3.下列有关微生物培养的叙述正确的是 ( D ) A.通常使用液体培养基分离获得细菌单菌落 B.若培养基需要调节pH,应该在灭菌后进行 C.用显微镜直接计数固体培养基中微生物数量 D.倒置平板可防止培养基被滴落的冷凝水污染,解析 常用固体或半固体培养基分离获得细菌单菌落,A错误;若培 养基需要调节pH,应该在灭菌前进行,B错误;显微镜直接计数法是测定
9、 培养液中微生物数量的方法,固体培养基上用涂布分离法直接计数单个 菌落数,C错误;平板倒置是为了避免冷凝的液体掉到培养基上,污染培 养基,D正确。,4.分离以尿素为氮源的细菌和分离大肠杆菌都使用了LB培养基,其成分 ( C ) A.前者含琼脂,后者不含琼脂和琼脂糖 B.两者都含有琼脂 C.前者含有琼脂糖,后者不含琼脂糖但含琼脂 D.两者都不含琼脂和琼脂糖,解析 琼脂和琼脂糖都可作为凝固剂,用于制备固体培养基。但琼 脂为混合物,含少量含氮化合物,琼脂加以纯化,去除含氮化合物就成为 琼脂糖。由于琼脂为混合物,其中含一定量的含氮化合物,因此不能用 于分离以尿素为氮源的细菌。琼脂糖为琼脂的纯化物,不含
10、含氮化合 物,可用于分离以尿素为氮源的细菌。,5.现有一升水样,梯度稀释至10-3倍。各取0.1 mL已稀释10-3倍的水样分 别接种到三个培养基上培养,记录的菌落数分别为15、16、17个,则每 升原水样中菌株数为 个。 ( D ) A.160 B.1.6103 C.1.6107 D.1.6108,解析 题中梯度稀释的倍数是10-3,三个培养基上菌落的平均数为(1 5+16+17)/3=16(个),则每毫升样品中菌株数为16/0.1103=1.6105(个),所 以每升原水样中的菌株数为1.6105103=1.6108(个)。,6.为了调查某学校附近河流的水质状况,该学校生物兴趣小组测定了河
11、 流水样中的细菌含量,并进行了细菌的分离等工作。回答下列问题:(1)如图,该小组采用的是 分离水样中的细菌。操作时,接 种环通过 灭菌,在第二次及以后的操作时,总是从上一次的末,端开始,这样做的目的是 。 (2)该实验组将接种好的培养皿在恒温箱中培养时倒置,其目的是 ;在培养基上产生的单个 菌落在生态学中可以被称为 。 (3)根据培养皿上菌落的平均数可以计算河水中该细菌的密度,但计算 的数据要比实际活菌的数目少,原因是 。除上述的活菌计数法外, 也是测,定微生物数量的常用方法。 (4)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀,一部分进行静置 培养,另一部分进行振荡培养。结果发现:振荡培养的细
12、菌比静置培养 的细菌生长速度快。分析其原因是: 。,答案 (1)划线分离法 灼烧 将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌 落 (2)防止形成的冷凝水滴落在培养基上产生杂菌污染 种群 (3) 当两个或者多个细胞连在一起时平板上观察到的是一个菌落 显微镜 计数 (4)振荡培养能提高培养液的溶解氧的含量,同时可以使菌体与 培养液充分接触,提高营养物质的利用率,解析 (1)从图中可明显看到三个划线区域,这说明该小组采用的是 划线分离法分离水样中的细菌。接种环是金属制品,可用灼烧灭菌。在 第二次及以后的操作时,总是从上一次的末端开始,这样做的目的是将 聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落。(2)将接种好的培养
13、皿在恒温 箱中培养时倒置,其目的是防止形成的冷凝水滴落在培养基上产生杂菌 污染。种群是生活在同一区域的同种生物全部个体的总和,因此在培养 基上产生的单个菌落在生态学中可以被称为种群。(3)根据培养皿上菌 落的平均数可以计算河水中该细菌的密度,但计算的数据要比实际活菌,的数目少,原因是当两个或者多个细菌连在一起时平板上观察到的是一 个菌落。除上述的活菌计数法外,显微镜计数也是测定微生物数量的常 用方法。(4)振荡培养能提高培养液的溶解氧的含量,同时可以使菌体 与培养液充分接触,提高营养物质的利用率,所以振荡培养的细菌比静 置培养的细菌生长速度快。,7.(1)用射线处理一些霉菌后,稀释并接种在以较
14、低浓度果胶为 的培养基中,可获得产果胶酶的高产菌株。通过观察比较培养基上 可判断菌株是否属于同一种类。 (2)在分离高产果胶酶菌种的实验操作中,对于获得纯化的果胶酶高产 菌单菌落影响最大的是 。 A.实验所用的霉菌孢子来源于多个菌株 B.涂布前涂布器未在酒精灯火焰上的灼烧灭菌 C.已添加果胶的蔗糖豆芽汁培养基作为选择培养基 D.实验操作过程中未打开超净台的过滤风,答案 (1)唯一碳源 菌落的形态特征 (2)C,解析 用于筛选产果胶酶的高产菌株的选择培养基应以果胶为唯一碳 源;可以根据菌落的形态特征来判断菌株是否属于同一种类;C项中碳源 不是唯一的。,一、无菌技术的知识归纳 1.灭菌目的:为了获
15、得纯净的培养物,关键是防止外来杂菌的污染。,考点突破,2.无菌操作的条件 (1)各种器皿必须是无菌的; (2)各种培养基必须是无菌的; (3)细菌转移操作的过程必须是无菌的。,3.三种常用灭菌方法的比较,二、大肠杆菌的培养与分离中应注意的问题 1.划线分离操作中的有关问题 (1)在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环,在划线操作结 束后,仍然需要灼烧接种环。,(2)在灼烧接种环之后,要等其冷却后再进行划线,以免接种环温度 太高,杀死菌种。 (3)在做第二次以及其后的划线操作时,要从上一次划线的末端开始划 线。每次划线后,线条末端细菌的数目比线条起始处要少,每次从上一 次划线的末端开始划线
16、,能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减 少,最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,2.进行恒温培养时,要将培养皿倒置的原因 如果正放培养皿,则皿盖上形成的水滴会落入培养基表面并且扩散开。 如果培养皿中已形成菌落,则菌落中的菌会随水扩散,菌落间相互影响, 很难再分成单菌落,达不到分离的目的。因此恒温培养时,培养皿必须 倒置。知能拓展 有关培养基的类型及选择问题,三、分离以尿素为氮源的微生物实验剖析 1.土样的获得:从有哺乳动物排泄物的地方取得。,2.实验步骤:,知能拓展 (1)用琼脂糖代替琼脂配制固体培养基。琼脂是未被纯化 的混合物,内含一定量的含氮化合物,不利于以尿素为氮源的细菌的筛 选。
17、 (2)培养基中的酸碱指示剂产生颜色变化(变红),标志着存在脲酶水解尿 素的作用,从而证明这一菌株可以以尿素为氮源。红色环状区域的大小 代表脲酶活性的强弱和含量的多少。红色区域越大,表明菌株利用尿素 的能力越强。 (3)与全营养培养基上的菌落数比较,尿素培养基上只有少数菌落,这一 现象表明能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占极小部分。,1.无菌技术的常用方法,名师点拨 对培养基、培养皿、接种环等不同的实验用具、器材及 实验操作者所用的消毒和灭菌的方法不同:接种工具如接种环等金属用 具使用灼烧灭菌;能耐高温的、需保持干燥的物品,如吸管、培养皿等 玻璃器皿和金属用具等,用干热灭菌;培养基一般用高压蒸汽
18、灭菌;牛奶 用巴氏消毒法灭菌;实验者的双手用70%的酒精消毒;水源用氯气消 毒。,2.微生物接种的常用方法,3.微生物数量的统计方法 常规的计数方法是涂布分离法和显微镜直接计数法。 (1) 涂布分离法 该法的基本原理:将待测含菌样品经适当稀释, 使其中的微生物充分分 散成单个细胞, 然后取一定量的稀释样品液, 接种到平板上。经过一定 时间培养后, 由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的单菌落, 即一个 单菌落应代表原样品中的一个活菌。最后统计菌落数, 根据其稀释倍 数和取样量, 换算出单位样品中所含的活菌数。,用涂布分离法计数时,一般选择菌落数在30300的平板计数,同时做一 系列浓度梯度实验,
19、探究合适的稀释度。对分解尿素的微生物计数时, 一般制备成10-2、10-3、10-4、10-5土壤稀释液。 (2)显微镜直接计数法 测定酵母细胞数或霉菌孢子数常采用在显微镜下直接进行计数的方法, 该法是将酵母菌或霉菌孢子悬液, 放在血球计数器载玻片与盖玻片之 间的计数室中,在显微镜下直接进行计数,是一种常用的微生物计数方 法。,典例1 2016浙江10月选考,32(一)请回答从土壤中分离产脲酶细菌和 脲酶固定化实验的有关问题: (1)LB固体培养基:取适量的蛋白胨、酵母提取液、NaCl,加入一定量的 蒸馏水溶解,再加 ,灭菌备用。 (2)尿素固体培养基:先将适宜浓度的尿素溶液,用 灭菌过的G6
20、 玻璃砂漏斗过滤,因为G6玻璃砂漏斗 ,故用于过滤除菌,然 后将尿素溶液加到已经灭菌的含有酚红的培养基中,备用。 (3)取适量含产脲酶细菌的10-4、10-5两种土壤稀释液,分别涂布接种到,LB固体培养基和尿素固体培养基上,培养48 h,推测固体培养基上生长 的菌落数最少的是 (A.10-5稀释液+尿素固体培养基 B.10-5 稀释液+LB固体培养基 C.10-4稀释液+尿素固体培养基 D.10-4稀释液 +LB固体培养基)。在尿素固体培养基上产脲酶细菌菌落周围出现 ,其原因是细菌产生的脲酶催化尿素分解产生 所致。 (4)制备固定化脲酶时,用石英砂吸附脲酶,装柱。再用蒸馏水洗涤固定 化酶柱,其
21、作用是 。,解题关键 培养基选择分解尿素的微生物的原理:培养基的氮源为尿 素,只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素,以尿素作为氮源;缺乏脲酶 的微生物由于不能分解尿素,缺乏氮源而不能生长发育繁殖,而受到抑 制,所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。方法:能合成脲 酶的细菌才能分解尿素.配制以尿素为唯一氮源的培养基,能够生长的 细菌就是能分解尿素的细菌。为检测尿素分解菌的存在与否,在以尿素 为唯一氮源的选择培养基中加入酚红指示剂,如果存在尿素分解菌,则 指示剂将变红色。,解析 (1)制备固体培养基需要加入琼脂。(2)培养基、实验用品灭菌 一般采用高压蒸汽灭菌,G6玻璃砂漏斗孔径很小,细菌不能
22、滤过,故可用 于过滤除菌。(3)LB固体培养基营养较为全面,尿素固体培养基以尿素 为唯一氮源,所以在10-5稀释液+尿素固体培养基上生长的菌落数最少, 细菌产生的脲酶催化尿素分解产生氨(或NH3),使pH升高,培养基中的酚 红指示剂就会变红。(4)用蒸馏水洗涤固定化酶柱,其作用为除去游离 的脲酶。,答案 (1)琼脂 (2)高压蒸汽 孔径很小,细菌不能滤过 (3)A 红色 环带 氨(或NH3) (4)除去游离的脲酶,1-1 某同学用新鲜的泡菜汁为实验材料分离纯化出乳酸菌,用来生产 酸奶。分离纯化所用固体培养基中因含有碳酸钙而不透明,乳酸菌产生 的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙。 (1)分离纯化乳酸菌
23、时,首先需要用 对泡菜汁进行梯度稀 释,然后采用 法进行分离,可获得乳酸菌的单菌落。 (2)推测分离纯化所用的培养基中加入碳酸钙的作用有 和 。分离纯化时应挑选出 的菌落作 为候选菌。,(3)获得纯化的乳酸菌后,可以利用纯牛奶作为原料制作酸奶,发酵常在 (A.有氧+常温 B.无氧+常温 C.有氧+低温 D.无氧+低温)条 件下进行。 如果使用的是加了某些抗生素的纯牛奶作原料制酸奶,很有可能会发酵 成怪味“酸奶”,其原因可能是 。,答案 (1)无菌水 涂布分离 (2)鉴别乳酸菌 中和产生的乳酸(或酸) 具有透明圈 (3)B 抗生素具有杀菌作用,会杀死乳酸菌,导致乳酸 发酵不能顺利进行,解析 (1
24、)分离纯化乳酸菌时,首先需要用无菌水对泡菜滤液进行梯度 稀释,在稀释度足够高的菌液里,聚集在一起的细菌将被分散成单个细 胞,从而能在培养基表面形成单个的菌落,有利于纯化乳酸菌。(2)在分 离纯化所用的培养基中加入碳酸钙,可以中和乳酸菌代谢过程中产生的 乳酸,乳酸菌落会产生溶钙圈,有利于乳酸菌的识别和分离。分离纯化 时应挑选出在平板上有透明圈的菌落作为候选菌。(3)乳酸发酵是厌氧 发酵,在常温下进行。抗生素具有杀菌作用,会杀死乳酸菌,导致乳酸发 酵不能顺利进行。,1-2 2018浙江11月选考,32(一),14分回答与微生物培养及应用有关的 问题: (1)对培养基进行高压蒸汽灭菌时,灭菌时间应从
25、 时开始计时。对于不耐热的液体培养基,一般可将其转入G6玻璃砂漏 斗中,采用 方式可较快地进行过滤灭菌。 (2)与酿造果醋相比,利用大米、高粱等富含淀粉的原料制醋,需增加 的过程。某醋化醋杆菌培养基由蛋白胨、酵母提 取物和甘露醇组成,其中甘露醇的主要作用是 。,(3)为筛选胞外-淀粉酶分泌型菌种,一般从 (A.果园树下 B. 肉类加工厂周围 C.米酒厂周围 D.枯树周围)获得土样,用无菌水稀 释,涂布到含有淀粉的选择培养基上培养,一段时间后在培养基表面滴 加碘液,可在菌落周围观察到透明的水解圈。若要筛选酶活性较高的菌 种,需挑选若干个 比值大的菌落,分别利用液体培 养基振荡培养进行扩增。然后将
26、培养液离心,取 用于检测酶活 性。,答案 (1)达到设定的温度或压力值 抽滤 (2)将淀粉分解成糖 作 为碳源 (3)C 水解圈直径与菌落直径 上清液,解析 (1)对培养基进行高压蒸汽灭菌时,灭菌时间应从达到设定的温 度或压力值时开始计时。对于不耐热的液体培养基,一般可将其转入G 6玻璃砂漏斗中,采用抽滤方式可较快地进行过滤灭菌,例如尿素。(2)大 米、高粱等原料中富含淀粉,醋化醋杆菌无法直接利用淀粉,应先将淀 粉分解为糖。某醋化醋杆菌培养基由蛋白胨、酵母提取物和甘露醇组 成,其中蛋白胨为微生物提供氮源,酵母提取物和甘露醇为微生物提供 碳源。(3)以淀粉原料生产酒时,淀粉需在淀粉酶的催化作用下水解为 可以进行发酵的糖。因此,可从米酒厂周围获得土样,筛选胞外-淀粉,酶分泌型菌种。淀粉遇碘液变蓝,淀粉在-淀粉酶的催化作用下水解生 成糊精,糊精滴加碘液,不会变蓝。在培养基表面滴加碘液,由于菌种产 生胞外-淀粉酶水解淀粉形成透明圈,透明圈越大,说明-淀粉酶的活性 越高。因此,挑选透明水解圈直径与菌落直径比值大的菌落来筛选酶活 性较高的菌种。然后利用液体培养基振荡培养进行扩增,再对培养液进 行离心取上清液得到淀粉酶提取液,用于检测酶活性。,
