1、MV_RR_CNJ_0051 光栅型荧光分光光度计检定规程 1. 光栅型荧光分光光度计检定规程的说明 编号 JJG(教委)025-1996 名称 (中文) 光栅型荧光分光光度计检定规程 (英文) Verification regulation for grating fluorescence spectrophotometer 归口单位 国家教育委员会 起草单位 国家教育委员会 主要起草人 田笠卿 批准日期 1997 年 1 月 22 日 实施日期 1997 年 4 月 1 日 替代规程号 无 适用范围 本规程适用于新安装、使用中和维修后的各种光栅型荧光分光光度计(以下简称仪器)的检定。 主要
2、技术要求 1. 外观要求2. 安装条件3. 检定环境4. 检定设备5. 检定项目和检定方法是否分级 无 检定周期( 年) 1 附录数目 3 出版单位 科学技术文献出版社 检定用标准物质 相关技术文件 备注 2. 光栅型荧光分光光度计检定规程的摘要 2 范围 本规程适用于新安装、使用中和维修后的各种光栅型荧光分光光度计(以下简称仪器)的检定。 2.1 原理 物质被某一波长的光照射后，会发射出比照射波长稍长的光，这种光称为荧光，它的过程是当物质的分子处于基态时，吸收光后，可跃迁到激发态，各激发态分子相互撞击而以无辐射能量损失的形式回到第一激发态的最低振动能级，这一振动能级的分子在返回基态时，所发射
3、的光称为荧光，但当它转入亚稳的三重线级，停留一段时间，返回至基态时所发出的光称为磷光，荧光(磷光)强度与物质浓度的关系为 FK I0(1e LC) 式中 F 荧光强度 K 仪器常数 量子效率 I0 激发光强度 荧光物质的摩尔吸收系数 L 荧光池厚度 C 荧光物质浓度 2.2 构成 仪器结构如图1所示，光源与检测器成直角方式安排。 检测器光 源 激发单色器 样 品 室 发射单色器 记录仪 图 1 仪器结构原理图 2.2.1 光 源 仪器的 光源有高压汞蒸气灯和氙弧灯， 后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm400nm范围内强度几乎相等，故较常用。 2.2.2 单色器 置于光源和样品室之间
4、的为激发单色器或第一单色器，置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二单色器，常采用光栅为单色器。 2.2.3 样品室 通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。测量液体时，光源与检测器成直角安排；测量固体时，光源与检测器成锐角安排。 2.2.4 检测器 一般用光电管或光电倍增管作检测器。 3 计量单位 采用我国公布的法定计量单位。 4 计量要求 新安装的各种仪器应符合仪器说明书中规定的计量要求，其技术指标应优于本规程表1中的规定。 使用中和维修后的各种仪器应符合本规程表1中规定的技术指标。 表 1 仪器技术指标 计量类别 技 术 指 标 波长准确度 0.5nm 波长重复性
5、 0.3nm 检出限 5.0 10 11g/ml 线性误差 2.0 信噪比 (S/N) 参照出厂说明的指标，已测出检出限的仪器，可不进行此项检定 光谱校正误差 带光谱校正的这类仪器在指定光谱校正的波长范围内进行校正 荧光池成套性 配套使用的荧光池的配套误差应不大于 1.0 5 技术要求 5.1 外观要求 仪器应有下列标志：仪器名称、型号、制造厂名、出厂时间和仪器编号。 5.2 安装条件 5.2.1 仪器应平稳地置于工作台上，各紧固件均应紧固良好，各调节旋钮、按键和开关均能正常工作， 无松动现象， 电缆线的插接件均应紧密配合， 接触良好， 外观不应有妨碍正常工作的机械损伤。 5.2.2 仪器的波
6、长度盘，狭缝带宽刻度，指示仪表度盘刻线、刻字应粗细均匀清晰，数显仪器的数字显示不应断线和缺线。 5.2.3 带记录仪的仪器，记录仪的满量程时间应符合出厂要求、记录仪绘图画线应清晰，不间断。 5.2.4 仪器所配荧光池各透光面应光洁，不得有灰尘、油污、划痕及任何裂纹。 5.3 检定环境 5.3.1 环境温度205，且相对稳定。相对湿度不大于70。电源电压220V22V。 5.3.2 仪器应平稳地放在工作台上，无强光直射在仪器上。 5.3.3 仪器周围无强磁场、电场干扰，无振动，无强气流影响。 5.3.4 检定前仪器应预热20min。 5.4 检定设备 5.4.1 便携式笔型低压石英汞灯或高压石英
7、汞灯，其光谱线波长值见附录A。 5.4.2 工作标准荧光池，其配套误差应不大于0.5。 5.4.3 秒表，分度值0.1s。 5.4.4 调压变压器(500VA)。 5.4.5 试验电压500V的兆欧表。 5.4.6 配制标准溶液所需的设备及器材见附录B。 5.4.7 0.05mol/L H2SO4溶液。 5.4.8 以0.05mol/L H 2SO4作溶剂的硫酸奎宁标准溶液，其 (g/ml)分别为：5.01011，1.00107，2.00107，4.00107，6.0107，8.0107和1.00106。 5.5 检定项目和检定方法 5.5.1 直观检定 用目力观察应符合本规程安装条件(5.2
8、)和检定环境(5.3)之要求。 5.5.2 波长准确度与重复性测定 5.5.2.1 激发单色器波长准确度与重复性的测定 5.5.2.1.1 将发射单色器置零级位置，灯室内正确安好笔型汞灯，响应时间“快”，扫描速度“慢”，通带“窄”，横坐标“小”，选择特殊方式中的“波长核对”。 5.5.2.1.2 以附录A汞谱线作参考波长，允许从附录表A1中任选分布均匀的5条谱线作参考波长。从短波向长波方向对激发单色器扫描。记录仪最大读数时的波长为测量值，连续测量3次。按5.5.2.1.3计算波长准确度和重复性。 5.5.2.1.3 按公式(1)计算波长正确度： 13 i=31ir(1) 式中 i 波长测量值
9、r 汞灯参考波长值 按公式(2)计算波长重复性： max| i13 i=31i| (2) 按公式(3)计算波长准确度： U (3) 5.5.2.2 发射单色器波长准确度与重复性的测定 5.5.2.2.1 将激发单色器波长置零级位置，其余条件同 5.5.2.1.1。 5.5.2.2.2 检定方法参照5.5.2.1.2。 5.5.2.2.3 计算方法参照5.5.2.1.3。 5.5.3 分辨率测定 5.5.3.1 激发单色器的分辨率 5.5.3.1.1 检定条件同 5.5.2.1.1。 5.5.3.1.2 扫描激发单色器应能分辨出汞三线365.02nm， 365.48nm和366.33nm所对应的
10、测量峰值。 5.5.3.2 发射单色器的分辨率 5.5.3.2.1 检定条件同 5.5.2.1.1。 5.5.3.2.2 扫描发射单色器应能分辨出汞三线365.02nm， 365.43nm和366.33nm所对应的测量峰值。 5.5.4 检出限与信噪比测定 5.5.4.1 检出限 5.5.4.1.1 以 0.05mol/L H2SO4溶液作空白，根据仪器类别选取对应浓度的硫酸奎宁标准溶液作样品。灵敏度置高档，选择适当的狭缝宽度，将激发波长置于350nm，扫描发射波长找出测量峰值对应的 EM，将发射波长固定在 EM。 5.5.4.1.2 分别对空白溶液和标准样品溶液连续交替11次测定，如果测量中
11、有一次被认为是由于外界干扰或操作失误而引起粗大误差，必须将该测量数据剔除。 5.5.4.1.3 由公式(4)计算每次测定的荧光强度： FiFi1Fi0 (4) 式中 Fi1 标准溶液的荧光强度 Fi0 空白溶液的荧光强度 由公式(5)计算荧光强度测量平均值： F1n i=n1Fi(5) 式中 n 测量次数 由公式(6)计算单次测量的标准偏差： i=n1(Fi F)2S n 1 (6) 式中 n 测量次数 由公式(7)计算检出限： DLF 2S (7) 式中 DL 检出限，指仪器能给出的二倍于标准偏差读数的标准溶液的质量浓度 标准溶液的质量浓度 5.5.4.2 信噪比(S/N) 置激发波长350
12、nm，激发和发射狭缝宽度10nm。用二次蒸馏水，调节灵敏度使发射波长为397nm时， 仪器示值在40左右。 再将发射波长退回到300nm， 调仪器零位。 扫描发射单 色器， 记录300nm 430nm发 射光谱曲线。 发射波长397nm附近的 峰值即为 S。 然后在峰值处采 用时间扫描记录2min，记录噪声曲线波动最大的峰值即为 N。 5.5.5 线性误差 5.5.5.1 置激发波长350nm，发射 波长450nm， 以 0.05mol/L H2S04溶液作 空白，调节仪器 灵敏度和狭缝宽度，使表2中的质量浓度最大的溶液示值在90附近。 表 2 硫酸奎宁标准溶液 标准溶液编号i 1 2 3 4
13、 5 6 i/(g/ml) 1.0010 72.0010 74.0010 76.010 78.010 71.0010 65.5.5.2 交替测定空白和各浓度标准溶液的荧光强度，每种溶液重复测量3次。 5.5.5.3 由式(4)，(5)计算每次测量的荧光强度及测量平均值。 由公式(8)计算平均荧光系数k ： 1F-ik6 i=n1 i(8) 式中 F-i 质量浓度为 i的溶液对应的荧光强度测量平均值 i 标准溶液的质量浓度 由公式(9)计算线性误差： F-ikiai(ki)(9) 5.5.6 光谱峰值强度的重复性测定 置激发波长350nm，激发和发射狭缝宽度为10nm，用1.00107g/ml的
14、硫酸奎宁溶液，调节灵敏度， 使发射波长为450nm时， 示值在80左右， 继续照射3min后， 对发射波长从365nm至500nm重复扫描3次。 由公式(10)计算重复性： Fmax| Fi13 i=31Fi| (10) 式中 Fi 每次测量荧光峰值。 5.5.7 光谱校正误差的测定 5.5.7.1 激发光谱校正 按仪器光谱校正说明书进行光谱校正误差检定。 5.5.7.2 发射光谱校正 按仪器光谱校正说明书进行光谱校正误差检定。 5.5.8 荧光池的成套性测定 5.5.8.1 用检定合格的荧光分光光度计进行荧光池成套性的检定。 5.5.8.2 置激发波长350nm，发射波长450nm，荧光池中
15、装入1.00106g/ml硫酸奎宁，放入光路时带有标志的一面正对进光方向。将仪器示值调至95，测量其它各荧光池的示值，凡示值差不大于1.0的荧光池可以配成一套。 5.5.9 其它 对于测量方式没有完全包括在本规程范围内的其它类型的荧光分光光度计，其主要指标参照上述检定方法进行检定，技术要求参照仪器说明书给出的指标。 6 计量管理 6.1 检定结果处理 经检定后的仪器，发给检定证书(附录C)。在检定结论中需明确说明被检定的仪器属于何种级别、是否合格、存在的问题和建议等。 6.2 检定周期 检定周期为1年，在此期间，当条件改变(例如更换光源灯、光电倍增管等)或对测量结果有怀疑时，都应进行检定。 注: 需要查阅全文, 请与出版发行单位联系.
