DB33 T 473-2004 β-内酰胺类、磺胺类和氨基糖苷类注链霉素型药物残留量的测定 注放射免疫快速检测法.pdf

1、ICS 07.100.30 C 53 备案号： 14979-2004 浙江省地方标准 DB33 DB33/T 473 2004 -内酰胺类、磺胺类和氨基糖苷类 链霉素型药物残留量的测定 放射免疫快速检测法 Determination of beta-lactam,sulfa drugs and aminoglycoside-St residues-Radioimmunoassay 2004-02-04发布 2004-03-04实施 浙江省质量技术监督局发布DB33/T 473 2004 I 前 言 本标准由杭州市质量技术监督局、杭州市农业局共同提出。 本标准由杭州市农产品检测站负责起草。 本标

2、准由浙江大学动物科学学院、华粤行仪器有限公司参加起草。 本标准主要起草人：胡学肖、杨华、周方、袁谦、方维焕、邹黎明、李容、姚建红。 DB33/T 473 2004 1 -内酰胺类、磺胺类和氨基糖苷类链霉素型药物残留量的测定 放射免疫快速检测法 1 范围 本标准规定了 -内酰胺类、磺胺类和氨基糖苷类链霉素型药物残留量的测定方法。 本标准适用 于牛乳及其制 品 （生鲜乳 、 灭菌乳 、 乳粉等） 和 畜 、 禽等 动物 肌肉及 内 脏中 -内酰胺 类和磺胺类药物残留的测定 ，以及牛乳及其制 品 中 氨基糖苷类链霉素型药物 （ 链霉素、 双氢 链霉素、 庆 大霉素 ） 残留的测定。 2 规范性引用文

3、件 下列文件中 的 条款通过 本标准的 引 用 而成为 本标准的 条款 。 凡是注 明 日期 的 引 用 文件，其随后所 有 的 修改单（不包括勘误 的内容 ）或修订版均不 适用 于 本标准 ，然而，鼓励根据 本标准 达成协议 的 各 方 研 究是否可使 用 这些文件 的 最新版 本。 凡是不注 明 日期 的 引 用 文件，其最新版 本适用 于 本标准。 GB/T 6682 分析实验 用 水 规 格 和 试验 方法 3 原理 样 品 中 残留的药物和药 片中 标 记 了 14 C或 3 H的药物 竞争结合其特异性受体，经免 疫 竞争 反应 后 离心 ， 取沉淀 物加 入闪烁液 ， 在液 体 闪

4、烁计数 器 中 计数 1分 钟 ， 将计数值与 标准 溶液 测定的 计数值进 行 比较 ， 计算待 测 样 品 中 药物的残留量。 4 试剂和溶液 4.1 水 应符 合 GB/T 6682二级 用 水 要 求 。 4.2 闪烁液 由 放射 免 疫 试 剂盒 公司提 供 。 4.3 牛乳及其制品测定用 CHARM II放射免疫试剂盒或其它公司同类产品 4.3.1 牛乳及其制 品 中 -内酰胺类药物测定用 放射 免 疫 试 剂盒 。 包括 ： 绿色 和 黄色 药 片 、 牛乳 阴 性 对照浓缩干 粉 、 青 霉素 G标准 干 粉等 。 4.3.2 牛乳及其制 品 中 磺胺类药物测定用 放射 免 疫

5、 试 剂盒 。 包括 ： 白色 和 粉 红 色 药 片 、 牛乳 阴 性 对照 浓缩干 粉 、磺胺 二甲嘧啶 标准 干 粉等 。 DB33/T 473 2004 2 4.3.3 牛乳及其制 品 中 氨基糖苷类链霉素型药物测定用 放射 免 疫 试 剂盒 。 包括 ： 白色 和 绿色 药 片 、 牛 乳 阴 性 对照浓缩干 粉 、链霉素标准 干 粉等 。 4.3.4 牛乳 阴 性 对照液配 制 ： 取 出 待 测药物 试 剂盒 中 的 牛乳 阴 性 对照浓缩干 粉 瓶 ， 加 入 100mL 40o C 左右 的 水， 震荡混匀 ， 冷却至 0 7 o C， 备 用。 4.4 动物组织测定用 CH

6、ARM II放射免疫试剂盒或其它公司同类产品 4.4.1 动物 组织 中 -内酰胺类药物测定用 放射 免 疫 试 剂盒 。 包括 ： 绿色 和 黄色 药 片 、 组织阴 性 对照浓 缩干 粉 、 青 霉素 G标准 干 粉 、 萃取缓冲液干 粉 和 M2缓冲液干 粉等 。 4.4.2 动物 组织 中 磺胺类药物测定用 放射 免 疫 试 剂盒 。 包括 ： 白色 和 粉 红 色 药 片 、 组织阴 性 对照浓缩 干 粉 、磺胺 二甲嘧啶 标准 干 粉 、 萃取缓冲液干 粉 和 M2缓冲液干 粉等 。 4.4.3 萃取缓冲液配 制 ： 取 出 待 测药物 试 剂盒 中 的 萃取缓冲液干 粉 瓶 ，

7、将瓶 中 干 粉 全部转移入 1000mL 容量 瓶 中， 用 水 定容 至刻度 ， 震荡混匀 ， 备 用。 4.4.4 M2缓冲液配 制 ： 取 出 待 测药物 试 剂盒 中 的 M2缓冲液干 粉 瓶 ， 加 入 50mL水， 震荡混匀 ， 备 用。 4.4.5 组织阴 性 对照液配 制 ： 取 出 待 测药物 试 剂盒 中 的 组织阴 性 对照浓缩干 粉 瓶 ， 加 入 10mL水， 震荡 混匀 ， 将 其 全部 加 入 30.0mL萃取缓冲液 （ 4.4.3）中， 在锥形瓶 中 混 合均 匀 ， 备 用。 4.5 青霉素 G标准溶液和阳性对照液配制 4.5.1 青霉素 G标准溶液配制 4

8、.5.1.1 青 霉素 G标准 贮备液 ： 浓度 为 1000ng/mL。 取 出 -内酰胺类药物 试 剂盒 （ 4.3.1或 4.4.1）中 的 青 霉素 G标准 干 粉 瓶 ， 准 确 加 入 10mL水， 震 荡混匀 ， 备 用。 4.5.1.2 牛乳及其制 品测定用 青 霉素 G标准 中 间工作液 ： 浓度 为 50ng/mL。 吸取 2.0mL青 霉素 G标准 贮备液 （ 4.5.1.1） 和 38.0mL牛乳 阴 性 对照液 （ 4.3.4）， 在锥形瓶 中 混 合 均 匀 ， 备 用。 4.5.1.3 牛乳及其制 品测定用 青 霉素 G标准 工作液 吸取 1.5mL、 2.5mL

9、、 5.0mL、 7.5mL、 10.0mL青 霉素 G标准 中 间工作液 （ 4.5.1.2），分 别移至 25mL 容量 瓶 中， 用 牛乳 阴 性 对照液 （ 4.3.4） 稀释 定容 至刻度 ， 混 合均 匀 ， 配 制成 3， 5， 10， 15， 20ng/mL 的标准 系 列 。 4.5.1.4 动物 组织 测定用 青 霉素 G标准 中 间工作液 ： 浓度 为 50ng/mL。 吸取 3.0mL青 霉素 G标准 贮备液 （ 4.5.1.1）、 27.0mL组织阴 性 对照液 （ 4.4.5） 和 30mL萃取缓冲 液 （ 4.4.3）， 在锥形瓶 中 混 合均 匀 ， 备 用。

10、DB33/T 473 2004 3 4.5.1.5 动物 组织 测定用 青 霉素 G标准 工作液 吸取 5.0mL、 7.5mL、 10.0mL、 12.5mL、 15.0mL青 霉素 G标准 中 间工作液 （ 4.5.1.4），分 别移至 25mL 容量 瓶 中， 用 萃取缓冲液 （ 4.4.3） 稀释 定容 至刻度 ， 混 合均 匀 ， 配 制成 10， 15， 20， 25， 30ng/mL的 标准 系 列 。 4.5.2 青霉素 G阳性对照液配制 4.5.2.1 牛乳及其制 品测定用 青 霉素 G阳 性 对照液 ： 浓度 为 5ng/mL。 吸取 1.0mL青 霉素 G标准 中 间工作

11、液 （ 4.5.1.2） 和 9mL牛乳 阴 性 对照液 （ 4.3.4）， 在小烧杯 中 混 合均 匀 。 4.5.2.2 动物 组织 测定用 青 霉素 G阳 性 对照液 ： 浓度 为 12.5ng/mL。 吸取 0.3mL青 霉素 G标准 贮备液 （ 4.5.1.1）， 加 入到 5.7mL组织阴 性 对照溶液 （ 4.4.5）中， 在小 烧杯 中 混 合均 匀 ，然后 从 中 吸取 2.0mL混 合 溶液 ， 加 入到 6.0mL萃取缓冲液 （ 4.4.3）中， 在小烧杯 中 混 合均 匀 。 4.6 磺胺二甲嘧啶标准溶液和阳性对照液配制 4.6.1 磺胺二甲嘧啶标准溶液配制 4.6.1

12、.1 磺胺 二甲嘧啶 标准 贮备液 ： 浓度 为 1000ng/mL。 取 出磺胺类药物 试 剂盒 （ 4.3.2或 4.4.2）中 的磺胺 二甲嘧啶 标准 干 粉 瓶 ， 准 确 加 入 10mL水， 震荡 混匀 ， 备 用。 4.6.1.2 牛乳及其制 品测定用磺胺 二甲嘧啶 标准 中 间工作液 ： 浓度 为 50ng/mL。 吸取 3.0mL磺胺 二甲嘧啶 标准 贮备液 （ 4.6.1.1） 和 57.0mL牛乳 阴 性 对照液 （ 4.3.4）， 在锥形瓶 中 混 合均 匀 ， 备 用。 4.6.1.3 牛乳及其制 品测定用磺胺 二甲嘧啶 标准 工作液 吸取 5.0mL、 7.5mL、

13、 10.0mL、 12.5mL、 15.0mL磺胺 二甲嘧啶 标准 中 间工作液 （ 4.6.1.2），分 别移 至 25mL容量 瓶 中， 用 牛乳 阴 性 对照液 （ 4.3.4） 稀释 定容 至刻度 ， 混 合均 匀 ， 配 制成 10， 15， 20， 25， 30ng/mL的标准 系 列 。 4.6.1.4 动物 组织 测定用磺胺 二甲嘧啶 标准 中 间工作液 ： 浓度 为 50ng/mL。 吸取 3.0mL磺胺 二甲嘧啶 标准 贮备液 （ 4.6.1.1）、 27.0mL组织阴 性 对照液 （ 4.4.5） 和 30mL萃取 缓冲液 （ 4.4.3）， 在锥形瓶 中 混 合均 匀

14、， 备 用。 4.6.1.5 动物 组织 测定用磺胺 二甲嘧啶 标准 工作液 吸取 5.0mL、 7.5mL、 10.0mL、 12.5mL、 15.0mL磺胺 二甲嘧啶 标准 中 间工作液 （ 4.6.1.4），分 别移DB33/T 473 2004 4 至 25mL容量 瓶 中， 用 萃取缓冲液 （ 4.4.3） 稀释 定容 至刻度 ， 混 合均 匀 ， 配 制成 10， 15， 20， 25， 30ng/mL 的标准 系 列 。 4.6.2 磺胺二甲嘧啶阳性对照液配制 4.6.2.1 牛乳及其制 品测定用磺胺 二甲嘧啶阳 性 对照液 ： 浓度 为 10ng/mL。 吸取 2.0mL磺胺

15、二甲嘧啶 标准 中 间工作液 （ 4.6.1.2） 和 8mL牛乳 阴 性 对照液 （ 4.3.4）， 在小烧杯 中 混 合均 匀 。 4.6.2.2 动物 组织 测定用磺胺 二甲嘧啶阳 性 对照液 ： 浓度 为 12.5ng/mL。 吸取 0.3mL磺胺 二甲嘧啶 标准 贮备液 （ 4.6.1.1）， 加 入到 5.7mL组织阴 性 对照溶液 （ 4.4.5）中， 在小烧杯 中 混 合均 匀 ，然后 从 中 吸取 2.0mL混 合 溶液 ， 加 入到 6.0mL萃取缓冲液 （ 4.4.3）中， 在小烧 杯 中 混 合均 匀 。 4.7 链霉素标准溶液和阳性对照液配制 4.7.1 链霉素标准溶

16、液配制 4.7.1.1 链霉素标准 贮备液 ： 浓度 为 10000ng/mL。 取 出氨基糖苷类链霉素型药物 试 剂盒 （ 4.3.3）中 的链霉素标准 干 粉 瓶 ， 准 确 加 入 10mL水， 震荡混 匀 ， 备 用。 4.7.1.2 牛乳及其制 品测定用链霉素标准 中 间工作液 ： 浓度 为 100ng/mL。 吸取 0.5mL链霉素标准 贮备液 （ 4.7.1.1）， 加 入到 50mL容量 瓶 中， 用 牛乳 阴 性 对照液 （ 4.3.4） 稀 释 定容 至刻度 ， 混 合均 匀 ， 备 用。 4.7.1.3 牛乳及其制 品测定用链霉素标准 工作液 吸取 2.5mL、 5.0m

17、L、 7.5mL、 10.0mL、 12.5mL链霉素标准 中 间工作液 （ 4.7.1.2），分 别移至 25mL 容量 瓶 中， 用 牛乳 阴 性 对照液 （ 4.3.4） 稀释 定容 至刻度 ， 混 合均 匀 ， 配 制成 10， 20， 30， 40， 50ng/mL 的标准 系 列 。 4.7.2 链霉素阳性对照液配制 4.7.2.1 牛乳及其制 品测定用链霉素 阳 性 对照液 ： 浓度 为 25ng/mL。 吸取 2.0mL链霉素标准 中 间工作液 （ 4.7.1.2） 和 6mL牛乳 阴 性 对照液 （ 4.3.4）， 在小烧杯 中 混 合 均 匀 。 5 仪器 和 设 备 5.

18、1 CHARM II 6600/7600分析 仪 或其 它 同类产品。 5.2 分析 天平 ： 最 小感 量 为 0.01g。 DB33/T 473 2004 5 5.3 可 调温 加 热 器 或水 浴锅 ： 20o C 100o C（ 温度 精 度 0.1 o C）。 5.4 离心 机 ： 转 速 不 低 于 3300转 /分 。 5.5 高速 组织 分 散机 ： 转 速 不 低 于 10000转 /分 。 5.6 旋涡 混 合 器。 5.7 普 通 冰箱 ： 带 冷 冻室 。 5.8 冰袋 5.9 连续 可 调移液 器 及 配 套 吸 头 ： 200 L 1000 L、 1mL 5mL。

19、5.10 专 用 试 管 及 配 套盖子 ： 13mm 100mm， 与 分析 仪 配 套 。 5.11 脱脂棉签 。 5.12 实验 室常 规 玻璃 器 皿 。 6 分析步骤 6.1 样 品制备 6.1.1 液 态 牛乳 ： 采 取 具 有 代表 性 的 液 态 牛乳（生鲜乳 、 灭菌乳等） 1000mL， 放入 冰箱 中 冷却至 0 7 o C， 密封保存 ， 备 用。 生鲜乳 保存 期不 超 过 5天 ，灭菌乳 保存 期不 超 过其 规定 时 间 。 6.1.2 乳粉 ： 采 取 具 有 代表 性 的 样 品 1kg， 用 四 分 法 缩 减 至 约 250g， 混匀 ， 装 入 样 品

20、 瓶 内 室 温 下 密封 保存 ， 备 用。 6.1.3 动物 组织 ：采 取 具 有 代表 性 的 样 品 1kg， 放 冰箱 冷 藏室 中 保存 （ 5天 内 不 测定的 样 品 须 冷 冻保存 ）， 备 用。 6.2 提取 6.2.1 液 态 牛乳 ： 将待 测 牛乳 混匀 ， 取 20mL， 测定 前 在 3300rpm的 转 速 下 离心 5分 钟 ， 去除上层脂肪 ， 下 层 牛乳样 品 直接 用 于 药物残留测定。 6.2.2 乳粉 ： 称 取 2g待 测 乳粉， 加 入 20mL水， 溶 解 混匀 ， 冷却至 0 7 o C， 备 用。 全 脂 乳粉 溶 解 混匀 后， 先

21、在 3300rpm的 转 速 下 离心 5分 钟 ， 去除上层脂肪 。 6.2.3 动物 组织 ： 切 下 约 50g全 精 肌肉或 内 脏， 将 其 剁碎 或 绞碎 ， 称 取 10g样 品加 入到 50mL离心 管 中， 同 时 加 萃取缓冲液 （ 4.4.3） 至 40mL刻度 处 。 将离心 管 中 的 组织 和 缓冲液全部 倒 入小烧杯 中， 用 高速 组 织 分 散机 均 质 1分 钟 （ 处理 不 同 样 品 时必须 用 水 清洗 分 散头 以 避 免 交叉污染 ） 。 将 均 质物 摇 匀 后 倒回原 来 的 离心 管 中， 将离心 管 放 置 在 802 o C的加 热 器

22、中 恒 温 规定 时 间 （ -内酰胺类药物 30分 钟 ， 磺胺类 药物 45分 钟 ）， 取 出 后 放 置 在 冰 水 浴 中 冷却 10分 钟 。 将混 合 物 在 3300rpm的 转 速 下 离心 10分 钟 ， 取 上 清 液 ， 用 M2缓冲液 （ 4.4.4） 将 pH值调至 7.5左右 ， 备 用。 DB33/T 473 2004 6 6.3 免疫 竞争反应 将 含 有 待 测药物 特异性受体 的药 片（ 颜 色 见表 1） 放入到 空 试 管 （ 5.9）中， 加 300 L水， 旋涡 混 合 约 10秒 钟 。加 入 规定 体 积 （体 积见表 1） 的 试 液 （ 阴

23、 性 对照液 、 阳 性 对照液 、标准 工作液 、 牛乳及 其制 品 或 动物 组织 样 液 ）， 旋涡 混 合 约 10秒 钟 ， 立即 加 入 含 有 14 C或 3 H同 位 素的药 片（ 颜 色 见表 1）， 在 旋涡 混 合 器 上 混 合 约 15秒 钟 ； 在 规定 温度 （ 温度 见表 1）下 加 热 3分 钟 ， 在 3300rpm的 转 速 下 离心 3 分 钟 。 取 出 试 管 ， 弃 去上清 液 ， 并 用 脱脂棉签 擦 去 残留 在 试 管 壁 上 的 脂肪 和 液 滴 （注 意 不 要 接 触 到沉淀 物 ） 。加 300 L水， 在 旋涡 混 合 器 上 将沉

24、淀 物 打 碎； 最后 加 入 3.0mL闪烁液 ， 旋涡 混 合 约 10秒 钟 ， 并 在 试 管上 加 上 配 套盖子 ， 备 用。 表 1 免疫 竞争反应条 件 药物类型 试 液 类 别 受体 药 片 的 颜 色 同 位 素药 片 的 颜 色 试 液 体 积 加 热 温度 牛乳及其制 品 绿色 黄色 5.0mL 85 1 o C -内酰胺类 动物 组织 绿色 黄色 2.0mL 55 1 o C 牛乳及其制 品 白色 粉 红 色 5.0mL 85 1 o C 磺胺类 动物 组织 白色 粉 红 色 4.0mL 65 1 o C 氨基糖苷类 链霉素型 牛乳及其制 品 白色 绿色 5.0mL

25、35 1 o C 6.4 测定 6.4.1 试剂和 仪器有效 性 确认 检测 阴 性 对照液 和 阳 性 对照液 各 3次 ， 求 出 其 每 分 钟液 体 闪烁 次 数 （ CPM值 ） 的 平 均 值 ， 与 试 剂盒 出 厂 计数 单 对比 ， 阳 性 对照 CPM平 均 值 除 以 阴 性 对照 CPM平 均 值应与 出 厂 计数 单 上 的 比值 相近 ， 允许偏 差 为 0.1， 但 不 能 超 过 0.7（ 如 超 出 允许范围 ， 应 重做 或 者 与 厂家联 系 ）。 6.4.2 测定 将 标准 工作液 和 待 测 样 液 依次 在 CHARM II 6600/7600分析

26、仪 或其 它 同类产品 上 进 行 60秒 钟 的 读 数 ， 各 读三次 ，分 别 记 录每次 的 CPM值 。测定 -内酰胺类药物 时 ， 读 取 14 C频道 上 的 CPM值 ； 测定磺胺类 和氨基糖苷类链霉素型药物 时 ， 读 取 3 H频道 上 的 CPM值 。 7 分析结果计算 和 表述 7.1 标准 工作曲线绘 制 以 待 测药物标准 工作液 的 浓度值 （ Cs）为 横坐 标 ， 对应 的 CPM值 （ CPMs）为 纵坐 标 ， 绘 制 标准 工作 曲线 。 7.2 结果计算 样 品 中 待 测药物残留量 ( g/kg)按 下 式 计算 ： DB33/T 473 2004

27、7 待 测药物残留量 ( g/kg)=V C/m 式 中 ： C 由标准 工作 曲线 求 得 的 待 测 样 液 CPM值 所 对应 的 浓度 ， ng/mL； m 试样 的质量 ， g； V 试样 提 取液 体 积 ， mL。 8 检 出限与允许差 8.1 检 出限 牛乳及其制 品 中 -内酰胺类、磺胺类和氨基糖苷类链霉素型药物的检出限 依次 为 3 g/kg、 10 g/kg、 10 g/kg； 动物 组织 中 -内酰胺类和磺胺类药物的检出限 分 别 为 10 g/kg、 10 g/kg。 8.2 允许差 每个 试样 称 取 两份 进 行 平 行测定 ，以其 算 术 平 均 值 为分析结 果 。 其分析结 果 的 相 对 偏差 应 不 大 于 10%。 9 其 他 本法 为 半 定量 快 速 测定法 ， 当 检 验结 果 出 现 异议 时 ，以 国家 标准方法 为 准。