1、 ICS 备案号： 辽 宁 省 地 方 标 准 DB21 DB21/T 1697 2008 辽宁绒山羊细管冷冻精液制作规程 （ Liaoning cashmere goat straw frozen semen manufacture regulations） 2008-12-05 发布 2009-01-01 实施 辽宁省质量技术监督局 发布 DB21/T 1697 2008 I 目 次 前 言 . II 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 术语和定义 1 4 规格与质量标准 1 5 制作程序 1 6 解冻 2 7 检查 2 8 包装 2 9 保存和取用 2 10 容器清洗 . 2 11
2、 细管冻精运输 . 2 DB21/T 1697 2008 II 前 言 本标准由辽宁省动物卫生监督管理局提出并归口。 本标准由辽宁省辽宁绒山羊育种中心、辽宁省畜牧科学研究院负责起草。 本标准的主 要起草人：刘兴伟、韩迪、豆兴堂、王世权 、刘庆权 。DB21/T 1697 2008 1 辽宁绒山羊细管冷冻精液制作规程 1 范围 本规程规定了辽宁绒山羊细管冷冻精液的技术要求、制作程序、解冻、检验、标记、包装、存放、取用、运输及容器清洗等方法。 本规程适用于辽宁绒山羊，其他品种绒山羊可参照本规程。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本规程的引用而成为本规程的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所
3、有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本规程。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本规程。 GB 5458 液氮生物容器 GB/T 1.1-1993 标准化工作导则 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 精子密度： 1ml 精液中的精子数。 有效精子数：有效精子数 =精液量 密度 活力。 精子活力： 37 环境下直线运动精子数占总精子数的百分率。 精子顶体完整率：顶体完整精子数占总精子数的百分率。 精子畸形率：畸形精子数占总精子数的百分率。 精子存活率：在 37 环境下保存 4h 时直线运动精子数占总精子数的百分率。 细菌数：一剂量冻精解冻后经培养所长出的菌落数。 4 规
4、格与质量标准 4.1 规格 0.25ml 剂型。 4.2 质量标准 4.2.1 精 子活 力 30% 。 4.2.2 每剂细管冻精 有效 精子数 1500 万个。 4.2.3 精子畸 形 率 20% 。 4.2.4 精子顶体 完整率 50% 。 4.2.5 细菌 数 1000 个。 4.2.6 解冻后的精子 存活时间 在 5 8 条件下精子保持 30%活力的 时间 12h ；在 37 条件下精子保持 30%活 力的时间 4.5h 。 4.2.7 标识 在冻精细管上 ,打印品种、羊号、生产日期。 4.2.8 灌装后必须封口严密 ,在解冻时不能进水，同时在细管冻精的前端留约 0.8cm 的空隙。
5、5 制作程序 5.1 采精种公羊的 标准 种公羊的体型外貌和生产性能均应符合一级以上种羊标准。种公羊必须体质健壮，无下列传染病：布鲁氏杆菌病、副结核病、口蹄疫、蓝舌病、及其它隐性遗传缺陷性疾病。 5.2 采精方法 应用假阴道法进行采精，采精前分别用温水和灭菌生理盐水清洗公羊阴茎和包皮。 5.3 原精质量标准 颜色为乳白色或淡 黄色 ,精子密度 15107/ml, 活力 60%, 畸形率 10% 。 5.4 精液的稀释 DB21/T 1697 2008 2 5.4.1 器具卫生 所用器具，保证清洁、无菌、无消毒剂残留。 5.4.2 稀释保护剂的配制 配制冻精用的稀释保护剂，必须用 新鲜的双重蒸馏
6、水、卵黄或在保质期内的无动物来源精子细胞膜保护剂，其它药品为分析纯化学试剂。如使用成品稀释液 ,则应选择国家认定的标准稀释液生产厂家生产的细管冻精稀释液。 5.5 降温和平衡 稀释后的精液，经 1 1.5h 逐渐降温到 4 5 ，然后在此温度下平衡 2 4h。 5.6 冷冻 将平衡后的细管精液移至 95 5 的低温环境中 ,冷冻 3min，然后浸入液氮中。 6 解冻 将液氮中的细管冻精取出 ,立即 浸没于 38 40 的温水中 ,轻轻摆动 约 20s 取出 ,用干净纱布擦 干 。 7 检查 每只种羊的细管冻精抽检 1 2 剂。保存的细管冻精 ,每 6 个月抽检一次 ,每次抽检 3 5 剂。 7
7、.1 解冻活力检查 细管冻精解冻后，分别在细管上、中、下部分别取精液少许置于显微镜下观察 3 5 个视野，目测视野中呈直线运动的精子数占总精子数的比例，估测出平均活力。 7.2 有效精子数测定 在采集原精后 ,用分光光度仪、红细胞计数板或精子密度检测仪测出原精的精子密度 ,再根据稀释倍数 ,计算出稀释后的精子密度 ,再根据解冻后的细管冻精活力计算出每剂细管冻精的有效精子数。 7.3 顶体完整率和畸形率测定 用姬姆萨染色法或 1000 倍的带光栅的相差显微 镜观测细管冻精的顶体完整率和畸形率，每个样品观察精子总 数 500 个。 7.4 解冻后存活时间测定 取同一位置的细管冻精 10 只 ,同时
8、浸入 38 40 的温水中，待解冻后同时置于 37 恒温水浴锅中，先测定第一剂细管冻精的活力 ,然后每隔 0.5h,观测第二剂细管冻精的活力 ,依此类推 ,直到水中的细管冻精的精子全部死亡或活力降到 30%为止 ,从而得到至精子全部死亡时的存活时间和解冻活力降至 30%时的存活时间。 7.5 细菌数检查 取 0.20ml 解冻后的精液样品，放入血清琼脂平面上，在 37 恒温箱中培养 24h，统计出现 的菌落数。 8 包装 0.25ml 细管冻精采用指形管包装 ,每个指形管中装有合格细管冻精 25 剂 ,每 8 个指形管包装于一个布袋内。 9 保存和取用 9.1 保存 检查合格的细管冻精贮存于装
9、有液氮的生物容器内 ,定期添加液氮 ,使细管冻精始终浸没于液氮中。在每个包装袋上注明种羊羊号、解冻后活力和数量。 9.2 取用 取细管冻精时 ,将冻精袋提升到液氮罐颈口下约 10cm处 ,用长镊子迅速将细管冻精取出进行解冻 ,操作时 间 10s, 需继续取出细管冻精 ,则将冻精包装袋浸入液氮中 ,再重复以上操作 ,取出的细管冻精停留在空气中的时间 5s 。 10 容器清洗 液氮生物容器，应在使用前后彻底检查和清洗。清理时，先用中性洗涤剂刷洗，再用 40 45温水冲洗干净，在室温下放置 48h 以上再充入液氮。长期贮存冻精的容器，应定期清洗。 11 细管冻精运输 必须使用合格的超低温生物运输容器进行运输。
