1、ICS 65.120 B 46 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 13612011 饲料中氯霉素的测定气相色谱质谱法 Determination of chloramphenicol in feed Gas chromatography mass spectrometry method 2011 - 03 - 16 发布 2011 - 04 - 16 实施安徽省质量技术监督局 发布DB34/T 13612011 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省畜牧兽医局提出。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：安徽省兽药饲料监
2、察所(安徽省畜产品质量安全检测中心)。 本标准主要起草人：刘红云、蔡一杰、吴蕾、明文庆、张莉、丁作坤、陶小平、钱志平、吴昊。 DB34/T 13612011 1 饲料中氯霉素的测定气相色谱质谱法 1 范围 本标准规定了饲料中氯霉素检验的气相色谱质谱测定方法。 本标准适用于饲料中氯霉素的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料 采样 3 试样制备 按 GB/T 14699
3、1 抽取有代表性的饲料样品，用四分法缩减取约 200 g，粉碎至过 0.45 mm 孔径的分析筛，混匀，装入磨口瓶中备用。 4 原理 饲料经磷酸缓冲液均质后，用乙酸乙酯提取。用硅胶和C 18 固相萃取柱对乙酸乙酯提取物进行净化和富集。 用N,O-双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）+ 三甲基氯硅烷（TMCS）衍生化，供气相色谱质谱进行定性和定量分析。 5 试剂和溶液 5.1 除非另有说明，本法所用试剂均为分析纯，水为符合 GB/T 6682 二级水的规定。 5.2 氯霉素标准品：纯度99。 5.3 标准储备液：准确称取氯霉素标准品适量，用甲醇溶解配制成 100 g/mL，作为标准储备溶液。4
4、 冰箱保存，有效期 1 个月。 5.4 标准工作液：精密量取适量氯霉素储备液，用甲醇稀释成浓度为 0.5、5.0、10.0、50.0、100.0、200.0 ng/mL 的标准工作液。4 保存 7 天。 5.5 衍生化试剂：N,O-双（三甲基硅烷基） 三氟乙酰胺（BSTFA）+ 三甲基氯硅烷 TMCS （99:1）。 5.6 pH 6.8 磷酸缓冲液：取 0.2 mol/L 磷酸氢二钾溶液 250 mL ，加 0.2 mol/L 氢氧化钠溶液 118 mL，加水使溶解成 1000 mL，摇匀，即得。 5.7 甲醇：色谱纯。 5.8 乙腈：色谱纯。 5.9 乙酸乙酯：色谱纯。 DB34/T 13
5、612011 2 5.10 二氯甲烷。 5.11 正己烷。 5.12 气相色谱质谱淋洗液：二氯甲烷正己烷=（1：1）。 5.13 固相萃取柱：规格 500 mg/6mL，填料 C18。 5.14 硅胶固相萃取柱：规格 1000 mg /6mL。 5.15 微孔滤膜：孔径 0.25 m，有机相。 6 仪器设备 6.1 气相色谱质谱仪。 6.2 高速冷冻离心机，不低于 10000 rmin。 6.3 饲料粉碎机。 6.4 氮吹仪。 6.5 旋转蒸发仪。 6.6 固相萃取装置。 6.7 分析天平，感量 0.0001 g，0.001 g。 6.8 振荡器。 6.9 涡旋混合器。 6.10 超声波清洗机
6、 6.11 离心管，50 mL。 6.12 梨形瓶，50 mL。 6.13 单通道可调移液器：110 L、550 L、50200 L、2001000 L。 7 测定步骤 7.1 试样提取 称取粉碎后的饲料样品 5 g（精确至 0.001 g）于 50 mL 离心管中，加入 l0 mL pH 6.8 磷酸缓冲液，混合均匀。用 30 mL 乙酸乙酯分 3 次提取，振荡 30 min， 10000 rmin 离心 5 min，合并提取液，在 55 水浴下旋蒸掉大部分溶剂，剩余的溶剂用氮气吹至近干，用 5 mL 5 乙腈水溶液溶解残留物。 7.2 净化 硅胶固相萃取小柱依次用 5 mL 乙腈、5 m
7、L 淋洗液活化；（7.1）项下的提取液残留物上样；5 mL气相色谱质谱淋洗液淋洗，5 mL 20乙腈水溶液洗脱。用 6 mL 乙酸乙酯分三次提取洗脱液，合并提取液并吹干，用 5 mL 5乙腈水溶液溶解残留物，待C 18固相萃取柱进一步净化。C 18小柱依次用 5 mL 乙腈、5 mL 水活化，上样，5 mL 水淋洗，5 mL 乙腈洗脱，收集洗脱液备用。 7.3 样品衍生化 用氮气吹干上述乙腈洗脱净化液，加入 100 L 衍生试剂，密封后 70 衍生 1 h，氮气吹干，加 0.5 mL 正己烷溶解。同时分别取标准工作系列（5.3）1 mL 用氮气吹干后，加入 100 L 衍生试剂，按试样同法操作
8、待气相色谱质谱分析。 7.4 气相条件 DB34/T 13612011 3 色谱柱：5苯基甲基聚硅氧烷，柱长 30 m，内径 0.25 m m，膜厚 0.25m 或性能相当的色谱柱。 进样口温度：250。 升温程序：起始温度 100（保持 1 min），以 30/m in 的速率升温至 280（保持 9 min）。 载气：氦气纯度 99.999。 流量：0.8 mLmin。 进样方式：不分流进样。 进样体积：1.0 L。 7.5 质谱条件 样品离子源：负化学电离源（反应气为甲烷）。 甲烷：纯度 99.999。 离子源温度：150。 传输线温度：250。 检测电压：500V。 选择离子收集模式
9、收集质荷比为 73，147，221，281，355，429 m/z 的 6 个碎片离子。 7.6 上机测定 取标准工作液和样品试液分别注入气相色谱质谱仪记录谱图，按外标法以峰面积进行计算。 8 定性定量方法 定性方法：样品与标准品保留时间的相对标准偏差不大于 0.5。特征离子基峰丰度与标准品相差不大于 20。 定量方法：以 73，147，221，2 81，355，429 峰面积之和进行校正定量。 9 结果计算 按照下式计算试样中药物残留的含量： ACsVXAs m =.(1) 式中： X 中药物的含量，单位为微克每千克（ g/kg）； A 样溶液的选择性离子色谱图中的峰面积响应值； As准溶
10、液的选择性离子色谱图中的峰面积响应值； V 容体积，单位为毫升（mL）； Cs准溶液的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）； m 样质量，单位为克（g）。 计算结果扣除空白值，平行测定结果用算术平均值表示，结果保留 3 位有效数字。 10 检测方法灵敏度、准确度、精密度 10.1 灵敏度 DB34/T 13612011 4 本方法的检测限为 0.1 g/kg。 10.2 准确度 本方法添加浓度 1.0 g/kg，回收率为 80120。 10.3 精密度 本方法的批内变异系数 CV10，批间变异系数 CV15。 DB34/T 13612011 5 AA 附 录 A （资料性附录） 氯霉素标准品衍生物的选择离子质谱图 图A.1 氯霉素标准品衍生物的选择性离子质谱图 _
