1、 ICS 11.220 B 41 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 13902011 动物疫病监测样品（血清、棉拭子）采集 技术规范 Technical code for Serum and swab Samples collection for Animal epidemic disease detection 2011 - 04 - 21 发布 2011 - 05 - 21 实施安徽省质量技术监督局 发布DB34/T 13902011 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省畜牧兽医局提出。 本标准起草单位：安徽省动物疫病预防与控制中心。
2、 本标准主要起草人：占松鹤、刘华、何长生、汪彤、沈艳、王立、江定丰、陈静、潘鑫、朱良强。 DB34/T 13902011 1 动物疫病监测样品（血清、棉拭子）采集 技术规范 1 范围 本标准规定了国家规定的强制免疫病种监测用血清、棉拭子样品的采集、样品编号、采样单填写、保存和运输的方法。 本标准适用于安徽省行政区域内春、秋两季国家强制免疫病种集中监测时所需血清、棉拭子样品采集、保存及运输。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 766-2004
3、 高致病性禽流感 无害化处理技术规范 NY/T 767-2004 高致病性禽流感 消毒技术规范 NY/T 768-2004 高致病性禽流感 人员防护技术规范 3 术语和定义 3.1 国家规定的强制免疫病种 指猪瘟、口蹄疫、高致病性猪蓝耳病、高致病性禽流感。 3.2 双拭子样品 指同一家禽的咽喉拭子和泄殖腔拭子，一并放置于一个加有 0.81.0 mL PBS（含有抗生素）离心管中的拭子样品。 4 采样前的准备 4.1 采样要求 4.1.1 根据采样目的，采集不同类型和不同数量的样品。 4.1.2 采样人员必须是兽医技术人员，熟悉采样器具的使用，掌握正确的釆样方法。 4.2 器具和试剂 4.2.1
4、 器具 DB34/T 13902011 2 4.2.1.1 血清采集器具：采样箱、镊子、75酒精棉、2.5 mL、5 mL、10 mL 一次性注射器、样品容器（如 1.5 mL 塑料离心管、10 mL 玻璃试管、自封塑料袋等）。 4.2.1.2 拭子采集器具：塑料盒（1.5 mL 塑料离心管专用）、无菌棉拭子、剪刀。 4.2.1.3 冷藏容器（如保温箱、保温桶、泡沫盒等）、冰袋。 4.2.2 试剂 加有抗生素的 pH 7.4 等渗磷酸盐缓冲液（PBS）（配制方法见附录 A）。 4.3 记录和防护材料 不干胶标签、签字笔、记号笔、采样单、记录本等；口罩、一次性 PE 手套或乳胶手套、防护服、防护
5、口罩、防护帽、胶靴等。 5 样品采集 5.1 基本要求 采样人员采样时按 NY/T 767-2004 做好消毒工作，按 NY/T 768-2004 做好防护工作。同种动物采样先到养殖场，后到散养户。采样过程要注意无菌操作，同时避免交叉污染。采样后的手套、防护服、口罩防、护帽、 包装袋等废弃物要按 NY/T 766-2004 进行无害化处理； 保定器具要按 NY/T 767-2004 做好消毒。 5.2 血清样品 5.2.1 采样方法 采集家禽血样时，使用 2.5 mL 或 5 mL 一次性无菌注射器，心脏或翅静脉采血，每只禽采全血 1.52.5 mL；采集猪血样时，使用 5 mL 或 10 m
6、L 一次性无菌注射器，仔猪或中等大小的猪前腔静脉采血，成年猪可用耳静脉采血，每头采全血 35 mL；采集牛血样时，使用 12 号以上针头穿刺颈静脉，接 5 mL 一次性注射器或 10 mL 玻璃试管，每头采全血 35 mL；采集羊血样时，使用 5 mL 一次性注射器（8 号以上针头），颈静脉采血，每头采全血 35 mL。抽血时，不宜将注射器抽满，抽血完毕后，将注射器内芯活塞抽至最大量程，以便析出血清。 5.2.2 离心方法 全血样品采集完毕后，不可立即放入冰盒中，最好在室温下（20）放置 24 小时（防止暴晒），环境温度较低时可在恒温培养箱 2037 环境下放置 1 小时，待全血凝固并析出血清
7、后，注入 1.5 mL 或 5 mL 离心管，8000 转离心 4 分钟或 3000 转离心 20 分钟，取上清液置于另一离心管内。 5.2.3 样品编号 在离心管管盖或管壁上用防水记号笔做好标记（与采样注射器编号一致），以“ A01,A02,A03、B01,B02,B03、C01,C02,C03 、D01,D02,D03 、E01,E02, E03 、F01,F02,F03” （字母与数字间不要加任何符号）模式编写。不同种类动物，英文字母不同（猪 A，羊 B，牛 C，鸡 D，鸭E，鹅 F），同一种动物英文字母相同，数字不同。编号不可出现重复。 5.2.4 血清要求 要求无溶血、无腐败，每份血
8、清不少于 0.8 mL，不同禽（或畜）只的血样不能混合。 DB34/T 13902011 3 5.3 拭子与粪便样品 5.3.1 采集方法 5.3.1.1 禽双拭子 将双头棉拭子（最好为木质）一端插入泄殖腔约 1.52 cm，旋转 23 圈后沾上粪便，将另一端插入喉头口及上颚裂处来回刮 35 次取咽喉分泌液，将样品端插入离心管剪下或折断，一并放入同一个含有抗生素 PBS 的（加 0.81.0 mLPB S）1.5 mL 塑料离心管中，盖上管盖，用防水记号笔做好标记。 5.3.1.2 猪鼻拭子： 将棉拭子一端插入猪鼻腔约 23 cm，旋转后沾上分泌液，将样品端置于含有抗生素 PBS 的（加0.8
9、1.0 mLPBS）1.5 mL 塑料离心管中，剪下或折断，盖上管盖，用防水记号笔作好标记。 5.3.1.3 粪便样品 野禽或珍禽采集 10 个新鲜粪便样品(每个样品 12 g)，置于内含有抗生素 PBS（加 0.81.0 mLPBS）的 1.5 mL 塑料离心管中。保存粪便和 泄殖腔拭子的 PBS 中抗生素浓度提高 5 倍（配制方法见附录 A）。 5.3.2 样品编号 在离心管管盖或管壁上用防水记号笔作好标记，以“ D01,D02,D03、E01,E02, E03 、F01,F02,F03、G01,G02,G03 、H01,H02,H03 ”（字母与数字间不要加任何符号）模式编写。不同种类动
10、物，英文字母不同（鸡 D，鸭 E，鹅 F，野鸟 G，其他 H），同一种动物英文字母相同，数字不同。编号不可出现重复。 5.4 采样单的填写 样品信息详见附录 B，采样单要用钢笔或签字笔逐项填写。所有表格填写之前须仔细阅读表格及下面的相关备注或填表说明。应完整、清楚、工整填写，不得使用省略或简易符号替代，不得随意对表格进行合并或删除。送样时，应将采样单（附录 B）、汇总表电子版（附录 C）随样品一起送到省级实验室。 5.5 包装要求 同一采样点的同一类样品要置于同一个自封塑料袋中，用记号笔或不干胶标签在自封袋外标记采样点名称（如某市某县某乡某村散养户，某市某县某养殖场, 某市某县某交易市场，某市
11、某县某野禽栖息地）、份数、编号范围等信息。同一县（区）的样品，按监测疫病的种类集中于另一较大自封塑料袋中，在自封袋外标记县区名称，监测疫病的种类，采样点数量和样品总数等信息。 6 保存和运输 6.1 样品置于保温容器中运输，保温容器必须密封，防止渗漏。 6.2 样品应在特定的温度下运输，拭子样品要作暂时的冷藏或冷冻处理，然后立即运送省级实验室。 若能在 4 h 内送到省级实验室，可只用冰袋冷藏运输。 如果超过 4 h，要作冷冻处理。应先将样品置于 -30 冻结，然后再在保温箱内加冰袋运输，DB34/T 13902011 4 经冻结的样品必须在 24 h 内送到。 若 24 h 不能送到省级实验
12、室，需要在运输过程中保持 -20 以下。 6.3 血清样品要与拭子样品分开存放。若 24 h 内运达省级实验室，在保温箱内加冰袋冷藏运输；若超过 24 h，要先冷冻后，在保温箱内加大量冰袋运输，途中不能超过 48 h。 6.4 各种样品到达省级实验室后，若暂时不进行处理，则应冷冻（最好 -70 或以下）保存，不得反复冻融。 DB34/T 13902011 5 AA 附 录 A （规范性附录） pH 7.4 的等渗磷酸盐缓冲液（PBS）的配制 A.1 pH 7.4 的等渗磷酸盐缓冲液（0.01 molL-1，pH7.4，PBS） NaCl 8.0 g KH 2P04 0.2 g Na 2HP04
13、12H 20 2.9 g KCL 0.2 g 将上列试剂按次序加入定量容器中，加适量蒸馏水溶解后，再定容至 1000 mL，调 pH 至 7.4，高压消毒灭菌 112 kPa 20 min，冷却后，保存于 4 冰箱中备用。 A.2 棉拭子用抗生素PBS（病毒保存液）的配制 取上述 PBS 液，按要求加入下列抗生素：喉气管拭子用 PBS 液中加入青霉素(2000 IUmL-1)、链霉素(2 mgmL-1)、丁胺卡那霉素(1000 IUmL-1)、制霉菌素(1000 IUmL-1)。粪便和泄殖腔拭子所用的 PBS 中，抗生素浓度应提高 5 倍。加入抗生素后应调 pH 至 7.4。 采样前将 PBS
14、 分装至 1.5 mL 塑料离 心管，每管中加这种 PBS 0.81.0 mL。 采粪便和泄殖腔拭子时，在塑料离心管中加含有 5 倍浓度抗生素的 PBS 0.81.0 mL，采样前冷冻保存。 DB34/T 13902011 6 BB 附 录 B （规范性附录） 安徽省动物疫病集中监测采样单 安徽省动物疫病集中监测采样单 采样地点 市 县（市、区） 乡（镇） 村 被采样单位名称 采样人 采样日期 被采样动物种类 存栏量（头/只） 被采样动物日龄 样品类型 采样数量 编号起止 代次 祖代 父母代 商品代 饲养方式 规模 散养 市场 野生 疫苗类型 疫苗生产厂家 疫苗批号 免疫剂量 免疫次数 末次免
15、疫时间被 采 样 动 物 免 疫 状 况 被采样单位 签字 本次抽样始终在本人陪同下完成，记录经核准无误，同意按期寄送。 经手人：（签名） 年 月 日 抽样人 签字 本次抽样严格按照要求及相关国家标准进行，并作记录如上。经手人：（签名） 年 月 日 注：此单一式贰份，原件盖采样单位公章随样品送省动物疫病预防与控制中心，复印件由采样单位保存。 DB34/T 13902011 7 CC 附 录 C （规范性附录） 病集中监测采样汇总表 市 县 年 病集中监测采样汇总表 序号 采样点 （地址单位名称） 采样日期动物 种类 存栏量 (头/只) 饲养方式代 次 日 龄 疫苗类型疫苗厂家免疫次数末次免疫时间 样品 类型 采样 数量 （份）编号起止_
