1、 ICS 67.100 C 53 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 15352011 乳制品中恩诺沙星、麻保沙星、二氟沙星残留量测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of enrofloxacin、 mabrofloxacin and difloxacin in milk products by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry 2011 - 11 - 15 发布 2011 - 12 - 15 实施安徽省质量技术监督局 发布DB34/T 15352011 I 前 言 本标准按
2、照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省质量技术监督局、安徽省食品质量安全检验方法标准化技术委员会提出。 本标准由安徽省食品质量安全检验方法标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：国家农副加工食品质量监督检验中心、安徽国家农业标准化与监测中心。 本标准主要起草人：顾亮、徐彦辉、丁磊、陶运来、罗亮、王苏红、刘坤、彭涛。 DB34/T 15352011 1 乳制品中恩诺沙星、麻保沙星、二氟沙星残留量测定 液相色谱-串联质谱法 1 范围 本标准规定了乳制品中恩诺沙星、麻保沙星、二氟沙星残留量测定的液相色谱串联质谱检测方法。 本标准适用于乳制品中恩诺沙星、麻保沙星、二氟沙星残留
3、量的测定。 本标准适用于该产品的风险预警监测及相关科学研究。 本标准中恩诺沙星、麻保沙星、二氟沙星的检测限均为 0.50 g/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 用 0.1 mol/L EDTA-Mcll vaine 缓冲液(pH=4.0)提取乳制品中的喹诺酮类抗生素，经离心后，上清液经 HLB 固相萃取柱净化；高效液相色谱-串联质谱测定，阴性样品基质加标工作曲线外标法定量。 4 试剂
4、 除非另有说明，所用试剂均为分析纯试剂，水：为 GB/T 6682 规定的一级水。 4.1 甲醇：色谱纯。 4.2 乙腈：色谱纯。 4.3 甲酸：色谱纯。 4.4 柠檬酸。 4.5 磷酸氢二钠。 4.6 正己烷。 4.7 氢氧化钠。 4.8 乙二胺四乙酸二钠。 4.9 磷酸氢二钠溶液(0.2 mol/L)：称取71.6 3 g 磷酸氢二钠，用水溶解，定容至 1000 mL。 4.10 柠檬酸溶液(0.1 mol/L)：称取 20 .01 g 柠檬酸，用水溶解，定容至 1000 mL。 4.11 Mcllvaine 缓冲液：将 1000 mL 0 .1 mol/L 柠檬酸溶液（4.10）与 6
5、25 mL 0.2 mol/L 磷酸氢 二钠溶液（4.9）混合，用盐酸或氢氧化钠调节 pH至 4.0 0.05。 4.12 EDTA-Mcllvaine 缓冲液（0. 1 mol/L）：称取 60.5 g 乙二胺四乙酸二钠（4.8）放入1625 mL Mcllvaine 缓冲液（4.11）中，振摇使其溶解。 4.13 甲醇水溶液：5%（体积分数）。 DB34/T 15352011 2 4.14 甲酸水溶液：0.1（体积分数）。 4.15 标准品：恩诺沙星、麻保沙星、二氟沙星(纯度98)。 4.16 标准储备液（1.0 mg/mL）：称取 0.01 g 恩诺沙星、麻保沙星、二氟沙星标准品，用甲醇
6、溶解并分别定容至 10.0 mL 棕色容量瓶中。-18 避光冷冻保存，保存期为三个月。 4.17 混合标准储备液(10 g/mL)：吸取适量恩诺沙星、麻保沙星、二氟沙星标准储备溶液（4.16），用甲醇配成混合标准溶液。各组分浓度为 10 g/mL。4 避光保存，保存期为三个月，使用前回温到室温。 4.18 HLB 固相萃取柱（200 mg，6 mL）或其它等效柱。 5 仪器和设备 5.1 液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾（ESI）离子源。 5.2 电子天平：感量 0.0001 g 和感量 0.01 g。 5.3 组织匀浆机。 5.4 高速冷冻离心机（转速 10000 r/min）。 5.5 固
7、相萃取装置。 5.6 酸度计。 6 测定步骤 6.1 提取 称取约 5.0 g（精确至 0.01 g）试样于50 mL聚丙烯离心管中，加入 40.0 mL 0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine 缓冲液（4.12），漩涡混匀，超声提取 10 min，10000 r/min 离心 5 min（ 温度低于5 ），取上清液（上清液若除脂不完全，可加 5 mL 正己烷除脂，离心分层取下层清液过柱）。 6.2 净化 HLB 固相萃取柱（200 mg，6 mL），使用前依次用 6 mL 甲醇、6 mL 水活化。将 6.1 提取的溶液以 23 mL/min 的速度过柱，弃去滤液，用 2 mL 5甲
8、醇水溶液（4.13）淋洗，弃去淋洗液，将小柱抽干，再用 6 mL 甲醇洗脱并收集洗脱液。洗脱液用氮气吹干后，用 1 mL 初始流动相溶液溶解定容，漩涡混匀，过 0.22 m 滤膜后上液相色谱-质谱联用仪测定。 6.3 基质加标标准工作曲线的制备 将混合标准工作液（4.17）用初始流动相逐级稀释成 2.5 g/L200.0 g/L 的标准系列溶液。称取与试样基质相应的阴性样品 5.0 g，按照 6.1、6.2 与试样同时进行提取和净化，用系列标准溶液定容至 1.0 mL。 6.4 测定 6.4.1 色谱条件 a) 色谱柱：Zorbax SB C18 柱（2.1 mm100 mm，1.8 m）或相
9、当者； b) 柱温：35 ； c) 进样量：20 L； d) 流速：0.3 mL/min； DB34/T 15352011 3 e) 流动相：流动相 A(0.1甲酸)+ 流动相 B（乙腈），参考梯度条件见表 1。 表1 液相色谱梯度洗脱条件 时间（min） 流速（L/min） 流动相A(0.1甲酸) 流动相B（乙腈） 0 0.3 95 5 5 0.3 50 50 6 0.3 50 50 6.2 0.3 95 5 16 0.3 95 5 6.4.2 质谱条件 a) 离子源：电喷雾离子源（ESI）； b) 扫描方式：正离子扫描； c) 检测方式：多反应监测（MRM）； d) 雾化气（NEB）、气帘
10、气（CUR）、碰撞气（ CAD）均为高纯氮气；使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求； e) 喷雾电压、碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度； f) 定性离子对、定量离子对、碰撞电压和碰撞能量等参数见表 2。 表2 多反应监测模式参数 名称 母离子（m/z） 子离子（m/z） 碰撞电压（V） 碰撞能量（V） 恩诺沙星 360 316.1 110 20 245 110 20 麻保沙星 363.2 345 110 15 320 110 5 二氟沙星 400.2 382.1 110 20 356.1 110 15 6.4.3 液相色谱-串联质谱测定 6.4.3.1 定性测定 各检测目标化合物以
11、保留时间和两对离子的（特征离子对/定量离子对 ）所对应的 LC-MS/MS 色谱峰面积相对丰度进行定性。 要求被测试样中目标化合物的保留时间与标准溶液中目标化合物的保留时间一致（偏差 0.5），同时要求被测试样中目标化合物的两对离子丰度比与标准溶液中目标化合物的丰度比一致，相对丰度50、2050、1020、10时，允许偏差分别为 20、25、30和 50。 6.4.3.2 定量分析 本标准采用外标校准曲线法定量测定。 以恩诺沙星、 麻保沙星、 二氟沙星的标准溶液浓度为横坐标，定量离子的峰面积为纵坐标，作校准曲线线性回归方程，以试样的峰面积与标准曲线比较定量。 7 平行试验 DB34/T 153
12、52011 4 按以上步骤，对同一试样进行平行测定。 8 结果计算 测定结果按式（1）计算： WVCX= . (1) 式中： X 样品中目标化合物含量，单位为微克每千克（ g/kg）； C 测定浓度，单位为微克每升（ g/L）； V 样品定容体积，单位为毫升（mL）； W 样品称样量，单位为克（g）。 注： 计算结果保留至小数点后两位。 9 方法回收率和精密度 9.1 回收率 本方法在 0.50 g/kg100.0 g/kg 添加浓度范围内，用阴性样品进行添加回收试验，恩诺沙星、麻保沙星、二氟沙星的回收率范围为 70115，相对标准偏差小于 10。 9.2 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值与算术平均值之比应不大于 10。 DB34/T 15352011 5 A A 附 录 A （资料性附录） 恩诺沙星、麻保沙星、二氟沙星标准物质的总离子流图和提取离子流图 图A.1 恩诺沙星、麻保沙星、二氟沙星标准物质的总离子流图和提取离子流图 _
