1、 ICS 11.220 B 41 DB51 四川省地方标准 DB51/T 14212012 动物犬恶丝虫检疫技术规范 2012 - 03 - 30 发布 2012 - 05 - 01 实施四川省质量技术监督局 发布DB51/T 14212012 I 目 次 前言 . . II 1 范围 . . 1 2 规范性引用文件 1 3 术语和定义 1 4 生活特性 . . 1 5 形态特征 . . 2 6 检疫方法 . . 2 7 综合判定 . . 3 附录 A（资料 性附录） 犬恶丝虫微丝蚴图片 4 附录 B（资料 性附录） 试剂的配制方法 5 附录 C（资料 性附录） 犬恶丝虫虫体粗抗原制备 6 参
2、考文献 . 7 DB51/T 14212012 II 前 言 本标准由四川出入境检验检疫局提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准发布。 本标准起草单位：四川出入境检验检疫局、四川农业大学。 本标准主要起草人：余华、杨光友、严玉宝、胡娟、崔鹏博、周岷江。 DB51/T 14212012 1 动物犬恶丝虫检疫技术规范 1 范围 本标准规定了动物犬恶丝虫的检疫方法。 本标准适用于动物血液内犬恶丝虫微丝蚴及血清抗体的检测和检疫。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适
3、用于本文件。 NY/T 541 动物疫病实验室检验采样方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 3.1 犬恶丝虫 Dirofilaria immitis 为双瓣科、恶丝属（ Dirofilaria）的虫种，又称犬心丝虫（ heart worm）。犬恶丝虫的成虫寄生于犬心脏的右心室及肺动脉（少数见于胸腔、支气管、皮下结缔组织等处）引起循环障碍、呼吸困难、贫血、猝死等症状，即犬恶丝虫病，属于一种丝虫病。除犬外，猫和多种野生动物以及人均可感染与发病。该病不仅危害犬猫等动物的健康，而且对人类健康亦构成威胁。 3.2 微丝蚴 Microfilariae 为犬恶丝虫的雌虫和雄虫交配后，雌虫胎生产出
4、的幼虫。微丝蚴通常生活于动物的外周血液中。 4 生活特性 犬恶丝虫寄生于犬、猫的右心室和肺动脉。中间宿主为蚊子（中华按蚊、白纹伊蚊、浅色库蚊等）。雌虫产出的微丝蚴进入外周血液内，在外周血液中可生存一年或一年以上，但被中间宿主吞噬以前不能进一步发育。夏季蚊子吸食动物血液，微丝蚴随血液进入蚊体内，在其体内约2周发育为第三期感染性幼虫。蚊刺吸犬、猫血液时，第三期幼虫从蚊子口器中逸出，迅速钻进动物宿主皮肤，在皮下结缔组织、肌间组织、脂肪组织和肌膜下发育，经第三次、第四次蜕皮成为童虫，然后进入静脉，移行到右心室及DB51/T 14212012 2 大血管内，继续发育为成虫。从蚊子叮咬感染到发育为成虫需6
5、7个月。成虫除寄生在右心室及肺动脉外，也可在后腔静脉、前腔静脉到肺动脉的毗连血管内寄生。在终宿主体内成虫可生存56年，并不断产生微丝蚴。 5 形态特征 5.1 微丝蚴 无鞘膜，大小为 218 329m5 7m，尾部细长，体内除含有体核外还具有神经环、排泄孔、排泄细胞、生殖细胞、肛孔及尾核。见附录 A。 5.2 成虫 虫体呈微白色，细长粉丝状。口由 6 个不明显的乳突围绕。雄虫长为 1220cm，后部呈螺旋状卷曲，有窄的尾翼膜，末端有尾乳突 11 对（肛前 5 对、肛后 6 对），交合刺 2 根，长短不等。雌虫长为25 30cm，尾端钝圆，阴门开口于食道后端。 6 检疫方法 6.1 设备和器械
6、光学显微镜、普通离心机（5000 r/min）、恒温培养箱、硝酸纤维素膜（NC膜），实验室其它常规器材。 6.2 试剂和材料 以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合GB/T 6682规定的二级水。 美蓝染色液； 包被缓冲液 CBS； BAS封闭液； PBS缓冲液； PBST 洗涤液； 底物溶液； 酶联葡萄球菌 A蛋白（ HRP-SPA） 检测动物的犬恶丝虫抗体阳性血清； 检测动物的犬恶丝虫抗体阴性血清； 犬恶丝虫虫体粗抗原（ 0.2 mg/mL）。 6.3 微丝蚴检测（改良柯氏试验） 按照NY/T 541“样品的采集”有关章节要求，每只待检动物取外周血 5 mL，在每 1 mL
7、抗凝血中加入 2%的甲醛 10 mL，混合后 1500 r/min离心 10 min，去上清液，取少量沉渣，美兰染色，镜检观察。 DB51/T 14212012 3 6.4 犬恶丝虫抗体检测（ Dot-ELISA 法） 6.4.1 试剂、血清及犬恶丝虫虫体粗抗原制备 6.4.1.1 0.05 mol/L 的包被缓冲液 CBS（ pH 9.6）制备见 B.2.1； 10 g/L 的 BSA 封闭液制备见 B.2.2； PBS （ pH7.4）缓冲液制备见 B.2.3； PBST 洗涤液制备见 B.2.4；底物溶液制备见 B.2.5。 6.4.1.2 按照 NY/T 54“样品的采集”有关章节要求
8、，每只待检动物采集血液 5 mL， 3 000 r/min 离心5 min，取上清（血清） ，备用。 6.4.1.3 犬恶丝虫虫体粗抗原制备见附录 C。 6.4.2 诊断膜制备 用铅笔在硝酸纤维素膜（ NC膜）光滑面将膜划成 5 mm 5 mm小方块，将 NC膜在蒸馏水中浸泡 20 min，完全湿透后取出，室温晾干，备用。用0.05 mol/L的包被缓冲液CBS（ pH 9.6）将犬恶丝虫虫体粗抗原原液稀释至 16.41 g/mL，备用。用微量加样器在小格中央滴加 1 L稀释好的虫体粗抗原， 37保温 30 min； 将包被好的 NC膜膜片浸入 10 g/L的 BAS封闭液中， 37封闭 50
9、 min。 将封闭好的膜片浸入 PBST洗涤液中泡洗 3次，每次 5 min。置室温晾干，即为诊断膜。可放入密闭干燥的塑料袋中备用。 6.4.3 操作步骤 6.4.3.1 用 PBS（ pH7.4） 缓冲液将待检血清、 酶联葡萄球菌 A 蛋白 （ HRP-SPA） 分别按 1:150 和 1: 4 000稀释，备用。 6.4.3.2 将事先预备的诊断膜浸入稀释好的血清中，置 37，反应 60 min。 6.4.3.3 将诊断膜浸入 PBST 洗涤液中泡洗 3 次，每次 5 min，取出用滤纸吸干。 6.4.3.4 将诊断膜浸入稀释好的 HRP-SPA 溶液中，置 37，反应 60 min。 6
10、.4.3.5 重复步骤 6.3.3.3。 6.4.3.6 将诊断膜浸入新鲜配制的底物溶液中，置 37，避光显色 20 min。 6.4.3.7 用自来水冲洗终止反应，晾干。 6.4.4 抗体检测结果判定 肉眼观察。每次试验时均须设立阳性血清对照和阴性血清对照，对照成立方可判定。依反应色泽深浅记录反应等级。+：斑点呈深蓝色；+：斑点呈蓝色；+：斑点呈灰蓝色；一：无可见斑点，即为阴性。 （可疑）：仅有微弱的界限不清的斑点。对可疑者作重复检测。 7 综合判定 动物外周血液检测查到符合5.1的犬恶丝虫微丝蚴形态特征的幼虫， 即可判定动物感染有犬恶丝虫。 或动物血清检测结果符合6.4.4中出现灰蓝色、蓝
11、色或深蓝色斑点即可判定动物感染有犬恶丝虫。 A DB51/T 14212012 4 附 录 A （资料性附录） 犬恶丝虫微丝蚴图片 图 1 鲜血涂片镜下活动的微丝蚴（ 40 ） 图 2 集虫法涂片下的微丝蚴（ 40 ） DB51/T 14212012 5 A B 附 录 B （资料性附录） 试剂的配制方法 B.1 改良柯氏试验 美蓝染色液：取 0.5 克美蓝，溶于 30 mL 95%酒精中，加 100 mL 0.01%氢氧化钾溶液，保存在棕色瓶内。 B.2 Dot-ELISA 法 B.2.1 0.05 mol/L 的包被缓冲液 CBS（ pH 9.6） 取 Na2CO31.59g、 NaHCO
12、32.93g，加蒸馏水定容至 1000 mL，置于 4保存。 B.2.2 10 g/L 的 BSA 封闭液 取 1g BSA（牛血清白蛋白） ，加蒸馏水定容至 100 mL，置于 4保存。 B.2.3 PBS（ pH7.4）缓冲液 取 KH2PO42H2O 0.2g， Na2HPO412H2O 2.9g， NaCl 8.0g， KCl 0.2g，加蒸馏水至 800 mL，调节 pH至 7.4，加蒸馏水定容至 1000 mL，置于 4保存。 B.2.4 PBST 洗涤液 取 0.5 mL Tween-20 加入 1000 mL PBS (pH7.4)，搅拌混匀，置 4保存。 B.2.5 底物溶液
13、（现配现用） 取 4.5 mg 4氯 1萘酚溶于 1.5 mL 无水甲醇中再加入 5 mL PBS 混合，最后加入 2 L 双氧水，混合后立即使用。 DB51/T 14212012 6 附 录 C （资料性附录） 犬恶丝虫虫体粗抗原制备 用 PBS 液将从动物体内收集到的犬恶丝虫虫体清洗 3 次，再用玻璃研体在冰浴上研磨，直到显微镜检查无完整虫体组织为止。然后将研磨好的组织匀浆倒入 Eppendorf 管（ EP 管）中， -20反复冻融 5 次， 4 10,000 r/min 离心 30 min，取上清液，无菌过滤（ 0.22 m）后作为可溶性抗原，并用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，分装后，
14、-20保存备用。 DB51/T 14212012 7 参 考 文 献 1 刘德昊，杨光友，王成东，等 . 犬恶丝虫抗体 dot-ELISA 检测方法的建立 . 中国兽医科学， 2008, 389(2): 106-110. 2 黄红松，胡登峰，王成东，等 . 犬恶丝虫病的诊断和防治研究进展 . 中国畜牧兽医， 2008, 35(3): 100-102. 3 黄红松，杨光友，王成东，等 . 犬恶丝虫病病原生物学研究进展 . 四川动物， 2008, 27(2): 316-319. 4 Nelson C T, McCall J W, Rubin S B, et al. 2005 Guidelines
15、for the diagnosis, prevention and management of heartworm (Dirofilaria immitis) infection in dogs. Vet Parasitol., 2005, 133(2-3): 255-266. 5 Fernandes G N, Rodrigues-Silva R, Moura ST. Epidemiological aspects of canine dirofilariasis in the metropolitan area of Cuiaba, Mato Grosso: the use of “Immu
16、noblot” and of modified Knott test. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science, 2000, 37(1/6): 467-474. 6 Mylonakis M E, Papadopoulos E, Koutinas A F. Comparative methodology for the detection and differentiation of circulating microfilariae of Dirofilaria immitis in the dog. Journa
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