1、 ICS:65.020.30 DB51B 40 备案号： 23072-2008 四川省地方标准DB51/T798-2008牛奶中氨苄青霉素残留检测方法 酶联免疫吸附测定(ELISA)法 Determination of Ampicillin Residues in Milk by Enzyme-linked Immunosorbent Assay 2008-06-06 发布 2008-06-15 实施四川省质量技术监督局发布DB51/T798-2008 I 目 次 前言 . II 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 制样 1 4 测定方法 1 5 检测方法灵敏度、准确度、精密度 3 DB
2、51/T798-2008 II 前 言 为了加强食品安全检测，保障人民群众的身体健康和生命安全，有效监测牛奶中的氨苄青霉素残留，我们建立了牛奶中氨苄青霉素残留检测方法酶联免疫吸附测定法（ELISA）法 本标准按GB/T1.12000 标准的结构和编写规则进行编制，GB/T 1.22000标准化工作导则 第2部分：标准中规范性技术要素内容的确定方法进行修改。 本标准由四川省畜牧食品局提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准发布。 本标准起草单位：四川省兽药监察所、四川省兽药残留监控中心。 本标准主要起草人：程江、彭莉、岳秀英、熊浩山、官艳丽、王海波、吴晓岚。 DB51/T798-2008
3、1 牛奶中氨苄青霉素残留检测方法 酶联免疫吸附测定(ELISA)法 1 范围 本标准规定了牛奶中氨苄青霉素残留量检测的制样和酶联免疫吸附测定法。 本标准适用于牛奶中氨苄青霉素的残留量的快速筛选检测。本方法的最低检出限为10.0g/L。对于可疑样品需用确证法确认。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 6682-1992 分析实验室用水规则和试验方法
4、3 制样 3.1 样品的制备 取适量新鲜的空白或供试牛奶，涡旋混合使之均匀，密封。 3.2 样品的保存 -20以下冰箱中贮存备用。 4 测定方法 4.1 方法提要或原理 将供试牛奶中的杂质用试剂沉淀后，取上清液以酶联免疫吸附测定法测定氨苄青霉素药物残留，其基本原理是抗原抗体反应。酶标板的微孔包被有偶联抗原，标样或样品中的氨苄青霉素和微孔条上预包被的偶连抗原竞争青霉素特异性抗体。通过洗涤除去没有与特异性抗体结合的酶标记抗原。加入底物液，结合到板上的酶标记物将底物转化为有色产物 。加入终止液，在450nm处测定吸光度值，吸光度值与试样中氨苄青霉素浓度呈反比。 4.2 试剂和材料 以下所用的试剂，除
5、特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合GB/T 6682规定的二级水。 4.2.1 0.36M亚硝基铁氰化钠溶液的配制 称取二水合亚硝基铁氰化钠(Na 2Fe(CN)5.NO.2H2O) 10.7g用水溶解定容至100mL即可。 4.2.2 1M 硫酸锌溶液的配制 称取七水合硫酸锌(ZnSO 4.7H2O) 28.8g用水溶解定容至100mL即可。 4.2.3 氨苄青霉素试剂盒（采用官方备案的试剂盒） 氨苄青霉素系列标准溶液 0g/mL 、0.2 g/mL、0.6 g/ml、1.8 g/mL、5.4 g/mL、16.2 g/mL 4.2.4 酶标板 8 条12 孔，包被有偶联抗原 4.2.5 酶
6、标二抗 4.2.6 氨苄青霉素抗体工作液 4.2.7 底物溶液A 4.2.8 底物溶液B 4.2.9 浓缩洗涤液 临用前用水稀释二十倍作为洗涤液 DB51/T798-2008 2 4.2.10 浓缩复溶液 临用前用水 1：1 稀释。 4.2.11 终止溶液 4.3 仪器和设备 4.3.1 酶标仪（配备450nm 滤光片） 4.3.2 天平 感量0.01g 4.3.3 分析天平 感量0.00001g 4.3.4 漩涡混合器 4.3.5 振荡器 4.3.6 冷冻离心机 4.3.7 离心管 20mL 4.3.8 微量移液器 单道20 L，50 L，100 L，1000 L；多道50-250 L 4.
7、4 测定步骤 4.4.1 试料的制备 试料的制备包括： 取混匀后的供试样品,作为供试试料。 取混匀后的空白样品,作为空白试料。 取混匀后空白样品,添加适宜浓度的标准溶液，作为空白添加试料。 4.4.2 提取和净化 4.4.3 精密量取 2mL 试料于离心管中，精密加入 0.36M 亚硝基铁氰化钠溶液 50 L，充分混合后加入1M 硫酸锌溶液 50 L，涡动 1min，于6000r/min 15离心 10min，取出上层液体 20 L 和已稀释的复溶液380 L 充分混合，取 50 L 用于分析。 4.4.4 样品测定程序（2026条件下操作） 4.4.4.1 使用前将试剂盒置于室温（2026）
8、平衡 30min 以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中，将不用的微孔条放入自封袋，保存于 28。将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品均需做两个平行实验。 4.4.4.2 加入50 L 标准溶液或试样溶液到微孔底部，每孔再加入 50 L 氨苄青霉素抗体溶液，轻轻振荡混匀，用盖板膜封板，25避光环境中反应 30min。 4.4.4.3 倒出孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，去除孔中液体。每孔加入 250 L 洗涤液，10s后倒出孔中液体，用吸水纸拍干，如此重复操作共洗板 5 次。 4.4.4.4 加入 100 L 酶标二抗到微孔底部，用盖板膜封
9、板，25避光环境中反应 30min。取出酶标板，如前述洗板 5 次。 4.4.4.5 加入50 L底物溶液A和50 L底物溶液B到微孔中，轻轻振荡混匀25避光环境显色15min。 4.4.4.6 加入50 L 终止液到微孔中，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于 450nm 处，测定每孔吸光度值（OD值）。 4.5 结果计算和表述 所获得的标准或样品吸光度值的平均值除以第一个标准（0标准）吸光度值的平均值再乘以 100%，得到以百分比给出的吸光度值，以式（1.1）表示： 百分吸光度值= 100% 1.1 式中: B为标准溶液或供试样品的平均吸光度值； B0为零浓度标准溶液的平均吸光度值。 以 X 轴为标
10、准溶液中氨苄青霉素浓度( g/L)的自然对数，Y轴为百分吸光度值，在半对数坐标纸上绘制标准曲线图。相对应的供试样品的浓度（ g/L）可以从标准曲线上查出。也可以求出回归曲线的DB51/T798-2008 3 方程，计算未知样品中氨苄青霉素的浓度。如果有专业计算机软件可直接求出供试样中氨苄青霉素的浓度。 注：检测结果小于10.0g/L时，可判为未检出，大于10.0g/ L时，判为可疑，需用确证法确认。 5 检测方法灵敏度、准确度、精密度 5.1 灵敏度 本方法在牛奶中的最低检测限为 1.60g/L，最低检出限为 10.0g/L。 5.2 准确度 本方法在牛奶中10.0g/L50.0g/L添加浓度的回收率为70.0%-110.0%。 5.3 精密度 本方法的批内变异系数CV 14.0%；批间变异系数CV 11.0%。
