1、 ICS:65.020.30 DB51B 40 备案号： 四川省地方标准DB51/T 862-2008畜禽组织中三聚氰胺的测定 Determination of melamine in livestock and poultry tissues 2008-11-26 发布 2008-12-01 实施四川省质量技术监督局发布DB51/T 862-2008 I 目 次 前言 . II 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 方法 1：高效液相色谱法 . 1 4 方法 2：气相色谱质谱法 . 3 5 在同一实验室由同一操作人员使用同一仪器完成的两个平行测定的相对偏差不大于 20%。 4 附录A （
2、规范性附录） 三聚氰胺标准图谱 . 5 DB51/T 862-2008 II 前 言 本标准的附录A为资料性附录。 本标准按GB/T.1.1-2000标准的结构和编写规则和GB/T.1.2-2002标准中规范性技术要素内容的确定方法要求进行编制。 本标准由四川省畜牧食品局提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准由四川省畜产品安全检测中心负责起草。 本标准起草人：林顺全、张静、李云、高庆军、廖峰、赵立军。DB51/T 862-2008 1 畜禽组织中三聚氰胺的测定 1 范围 本标准规定了测定畜禽组织中三聚氰胺的含量的高效液相色谱法 (HPLC)和气相色谱质谱联用法(GC-MS)，
3、其中GC-MS 法为确证法。 本标准适用于畜禽肌肉及内脏中三聚氰胺的测定。 本标准中HPLC 法最低定量限为2.0mg/kg ，GC-MS 法最低定量限为0.05mg/kg 。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 方法 1：高效液相色谱法 3.1 原理 试样经乙醚脱脂后用三氯乙酸溶液提取，提取液离心后经混合
4、型阳离子交换固相萃取柱净化，洗脱物吹干后用甲醇溶液溶解，用高效液相色谱仪进行测定。 3.2 试剂与材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂和符合GB/T6682 的三级水，色谱用水符合GB/T6682 一级水的规定。 3.2.1 甲醇：色谱纯。 3.2.2 乙腈：色谱纯。 3.2.3 氨水：浓度 25%28% 。 3.2.4 混合型阳离子交换固相萃取柱：60mg，3mL 。 3.2.5 三氯乙酸溶液 10g/L：称取 10g 三氯乙酸加水至 1000mL。 3.2.6 氨水甲醇溶液：量取 5mL 氨水，用甲醇定容至 100mL。 3.2.7 乙酸铅溶液：取 2.2g 乙酸铅用约 30mL 水溶解后
5、定容至 100mL。 3.2.8 滤膜：0.45m ，有机相。 3.2.9 甲醇溶液：200mL 甲醇(3.2.1) 加入 800mL 一级水，混匀。 3.2.10 流动相：称取 2.16g 辛烷磺酸钠和 2.10g 柠檬酸于 1L 容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度。取该溶液 900mL 加入 100mL 乙腈(3.2.2) 。 3.2.11 三聚氰胺标准品( 纯度99%) 。 3.2.12 三聚氰胺标准溶液 3.2.12.1 标准储备液：称取 100mg(精确到 0.1mg)的三聚氰胺标准品，用甲醇溶液(3.2.9) 溶解并定容于 100mL 容量瓶中，该溶液浓度为 1mg/mL，于 4冰箱内
6、贮存，有效期 3 个月。 3.2.12.2 标准中间液：吸取标准储备液 5.00mL，于 50mL 容量瓶内，用甲醇溶液(3.2.9) 定容至 50mL，该溶液三聚氰胺浓度为 100g/mL，于 4冰箱内贮存，有效期 1 个月。 DB51/T 862-2008 2 3.2.12.3 标准工作液：用移液管分别移取标准中间液 2mL、 5mL、 10mL、 15mL、 20mL 于 5 个 100mL容量瓶内，用甲醇溶液(3.2.9) 定容，该溶液三聚氰胺浓度为 2.0g/mL、 5.0g/mL、 10g/mL、 15g/mL、20g/mL。于 4冰箱内贮存，有效期 1 周。 3.3 仪器与设备
7、3.3.1 高效液相色谱仪，配有二极管阵列检测器或紫外检测器。 3.3.2 离心机：10000r/min。 3.3.3 涡旋混合器。 3.3.4 带盖塑料离心管：50mL 3.3.5 氮吹仪，可控温至 60。 3.3.6 固相萃取装置。 3.3.7 实验室用绞碎机。 3.3.8 震荡摇床。 3.4 试样制备 猪肉、猪肝：取适量新鲜或冷冻的空白或供试组织，绞碎并使均匀。 试样放入聚乙烯瓶中-16 -20 条件下保存。 3.5 测定步骤 3.5.1 提取 称取 2g 试样( 精确至 0.01g)于带盖塑料离心管（3.3.4），加入约 25mL 乙醚，摇床上振荡 20min，弃去乙醚，准确加入 18
8、mL 三氯乙酸溶液(3.2.5) 和 2mL 乙酸铅溶液(3.2.7) ，摇匀，涡旋提取 2min，在10000r/min 离心机上离心 5min，上清液备用。 3.5.2 净化 分别用3mL 甲醇，3mL 水活化混合型阳离子交换固相萃取柱，准确移取10mL 上清液分次上柱，控制过柱速度在1mL/min 以内。再用3mL 水和3mL 甲醇洗涤混合型阳离子交换固相萃取柱，抽近干后用氨水甲醇溶液 (3.2.6)6mL洗脱。洗脱液5 0氮气吹于，准确加入甲醇溶液 (3.2.9)1.0mL，涡旋振荡30s ，过0.45m滤膜，上机测定。 3.5.3 液相色谱条件 色谱柱：C18柱，柱长150mm ，内
9、径4.6mm ，粒度5 m；或性能相当的色谱柱。 柱温：30。 流动相流速：1.0mL/min 。 检测波长：240nm 。 3.5.4 测定 按照保留时间进行定性，试样与标准品保留时间的相对偏差不大于2% ，单点或多点校正外标法定量。待测样液中三聚氰胺的响应值应在工作曲线范围内。 3.6 结果计算和表述 3.6.1 试样中三聚氰胺的含量 X，以质量分数毫克每千克(mg/kg) 表示，单点校正按式(1) 计算： nmAsVCsAX = (1) 式中： V净化后加入的甲醇溶液体积，单位为毫升(mL) ； As三聚氰胺标准溶液对应的色谱峰面积响应值； A试样溶液对应的色谱峰面积响应值； Cs三聚氰
10、胺标准溶液的浓度，单位为微克每毫升( g/mL)； m试样质量，单位为克(g) ； n稀释倍数。 DB51/T 862-2008 3 多点校正按式(2) 计算： nmVCxX = (2) 式中： V净化后加入的甲醇溶液体积，单位为毫升(mL) ； Cx标准曲线上查得的试样中三聚氰胺的浓度，单位为微克每毫升( g/mL)； m试样质量，单位为克(g) ； n稀释倍数。 3.6.2 结果表示 平行测定结果用算术平均值表示，结果保留三位有效数字。 3.7 重复性 在同一实验室由同一操作人员使用同一仪器完成的两个平行测定的相对偏差不大于10% 。 4 方法 2：气相色谱质谱法 4.1 方法原理 试样经
11、乙醚脱脂后用三氯乙酸溶液提取，经混合型阳离子交换固相萃取柱净化，用N ，O 双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)衍生化，以气相色谱质谱联用仪进行定性和定量。 4.2 试剂和材料 4.2.1 衍生化试剂：BSTFA+1% 三甲基氯硅烷(TMCS) 。 4.2.2 吡啶：优级纯。 4.2.3 其他试剂和材料同 3.2.13.2.8、3.2.11、3.2.12。 4.2.4 标准工作液：用移液管分别吸取标准中间液(3.2.12.2) 适量，用甲醇稀释至三聚氰胺的浓度分别为 0.05g/mL、0.1 g/mL、0.5 g/mL、1.0 g/mL、2.0 g/mL、5.0 g/mL 的标准工作液。 4.
12、3 仪器和设备 4.3.1 气相色谱质谱联用仪。 4.3.2 其他同 3.3.23.3.8。 4.4 分析步骤 4.4.1 前处理同 3.5.13.5.2，但需根据洗脱液中三聚氰胺的浓度用甲醇进行适当稀释。 4.4.2 衍生化 取4.4.1 的稀释液适量用氮气吹于，加入200 L的吡啶和200 L的衍生化试剂(4.2.1) ，混匀，70反应30min。同时，用三聚氰胺标准系列(4.2.4) 或相应浓度单点标准做同步衍生。 4.4.3 测定 4.4.3.1 GC-MS 条件 色谱柱：柱长30m ，内径0.25mm ，甲基苯基聚硅氧烷涂层，膜厚0.25 m。 载气：氦气，流速为1.3mL/min
13、。 进样量：1 L。 进样口温度：250； 升温程序：起始温度75，持续1.0min，以30/min升温至300，保持2.0min。 传输线温度：280。 运行时间：10.5min。 扫描范围：60m/z 400m/z 。 扫描模式：选择离子扫描。监测离子99m/z 、171m/z 、327m/z 、342m/z 。 离子源温度：230。 EI源轰击能：70eV 。 DB51/T 862-2008 4 4.4.3.2 测定 定性方法：试样与标准品保留时间的相对偏差不大于0.5% ，特征离子丰度与标准品相差不大于20% 。 定量方法：以342、327、171和99峰面积之和进行单点或多点校正定量
14、。 4.5 结果计算和表述 4.5.1 试样中三聚氰胺的含量 X，以质量分数毫克每千克(mg/kg) 表示，单点校正按式(3) 计算： nmAsVCsAX = (3) 式中： A试样溶液对应的色谱峰面积响应值； As三聚氰胺标准溶液对应的色谱峰面积响应值； Cs标准工作液中三聚氰胺的浓度，单位为微克每毫升( /mL)； V用于衍生的试样溶液(4.4.2) 体积，单位为毫升(mL) ； m试样质量，单位为克(g) ； n稀释倍数。 多点校准时，可用公式(4) ： nmVCxX = (4) 式中： V用于衍生的试样溶液(4.4.2) 体积，单位为毫升(mL) ； Cx由标准曲线而得的样液中三聚氰胺
15、的含量，单位为微克每毫升( g/mL)； m试样量，单位为克(g) ； n稀释倍数。 4.5.2 平行测定结果用算术平均值表示，结果保留三位有效数字。 4.6 重复性 5 在同一实验室由同一操作人员使用同一仪器完成的两个平行测定的相对偏差不大于 20%。 DB51/T 862-2008 5 附 录 A （规范性附录） 三聚氰胺标准图谱 图A.1 三聚氰胺标准色谱图 图A.2 三聚氰胺紫外光谱图 DB51/T 862-2008 6 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50 10.002000004000006000008000001000000120000014000001600000180000020000002200000时间丰度TIC: st.Ddata.ms7.168A.3 三聚氰胺标准品衍生物选择离子色谱图 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 34001000002000003000004000005000006000007000008000009000001000000m/z丰度扫描 295 (7.168 分): st.Ddata.ms327.0171.099.0A.4 三聚氰胺标准品衍生物选择离子质谱图
