1、分类号X41备案号9489-2001中华人民共和国轻二二行业标准QB 2525一2001食品添加剂a一葡萄糖转普酶2001-11-15发布2002-05-01实施中国轻工业联合会发布QB 2525-2001前言本标准的全部技术内容为强制性。食品添加剂a-葡萄糖转普酶是由黑曲霉(Aspergillus niger)发酵法生产，经热处理、过滤、浓缩提纯制取.供食品工业生产作加工助剂用。本标准由中国轻工业联合会综合业务部提出。本标准由全国食品发酵标准化中心归口。本标准由中国食品发酵工业研究所、北京凯赛生物技术有限公司负责起草。本标准主要起草人:张启先、吴玉宏、刘莲芳。中华人民共和国轻工行业标准食品添
2、加剂QB 2525-2001a-葡萄糖转昔酶范围本标准规定了食品添加剂a-葡萄糖转昔酶(Food additive一a-Glucosidase)的技术要求、试验方法、检验规则和标志、包装、运输、贮存。本标准适用于由黑曲霉(Aspergillas niger)发酵法生产，经热处理、过滤、浓缩提纯制取而得的食品添加剂a-葡萄糖转昔酶。供食品工业生产作加工助剂用。2引用标准下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB/T 8449-1987食品添加剂中铅的测定方法GB/T 8
3、450-1987食品添加剂中砷的测定方法GB/T 8451一1987食品添加剂中重金属限量试验方法GB 4789.2-1994食品卫生微生物学检验菌落总数测定GB 4789.3-1994食品卫生微生物学检验大肠菌群测定GB 4789.4-1994食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验GB 4789.6-1994食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验QB/T 1803-1993工业酶制剂通用试验方法3技术要求3.1性状本品为褐色液体。3.2理化指标理化指标应符合表1的规定。3.3微生物指标微生物指标应符合表2的规定。中国轻工业联合会2001-11-15批准2002-05-01实施1OB 2525-2
4、001表1项目指标a-葡萄糖转普酶活力，UMIL300000糖化酶活力，U/mL300pH4.505.50砷(As), mg/kg3铅(Pb). mg/kg5重金属(以Pb计)，mg/kg(30表2项目指标菌落总数，cfu/ML共1x1了大肠菌群，MPN/100 mL-3000沙门氏菌不得检出埃希氏大肠杆菌不得检出4试验方法本试验所用的试剂和水，在没有其他特殊要求时，均使用分析纯试剂和蒸馏水或相当纯度的水。4.1 a-葡萄糖转普酶活力的测定4.1.1原理用a-葡萄糖转普酶作用底物a一甲基一D-葡萄糖昔生成葡萄糖，所生成的葡萄糖与含有葡萄糖氧化酶、过氧化酶的4-氨基安替比林(4-Aminoant
5、ipyrin)和酚试剂进行显色反应来定量测定。其化学反应式如下:a一甲基一D-葡萄糖进登生令D-葡萄糖十甲醇D-葡萄糖一卫壑鲤些竺叶葡萄糖酸十H202H2O:十4-氨基安替比林十酚-丝丝塑V ,苯醒4.1.2试剂和溶液a) 0.1 moVL乙酸溶液:将乙酸(CH;COOH) 6.0g溶于水，稀释至1000ML;b) 0.1 moUL乙酸钠溶液:将乙酸钠(CH3COONa) 8.20g溶于水.稀释至1000ML;c) 0.02mol/L乙酸一乙酸钠缓冲液(pH5.0)将0.1 mol/L乙酸溶液20 mL溶于水，稀释至100ML(试剂A);将0.1 mol/L乙酸钠溶液20 mL溶于水，稀释至1
6、00 ML(试剂B):将A和B混合，调pH至5.0.d) Tris-磷酸缓冲液(pH7.2):将Tris(径甲基)氨基甲烷C H2NC (CH20H) 3l 36.3 gOB 2525-2001和二水磷酸二氢钠(NaHZPO4 , 2H,0) 50. 0 g溶于900 ML水，用2 mol/L盐酸溶液调pH至7.2，用水稀释至1000 ML;e) 0. 4% 4-A,基安替比林溶液:将4-I,基安替比林(CHHtaONa) 200 mg溶于水，稀释至50 ML;f) 5%苯酚溶液:将苯酚(QH,OH) 5 g于60溶于50 ML水，将溶液冷却至室温，用水稀释至100 mL;幻4-氨基安替比林一
7、苯酚显色剂:在Tris-磷酸缓冲液(pH7.2) 40mL中.加入葡萄糖氧化酶(5 mg葡萄糖氧化酶Amano 2) 550单位和过氧化物酶(0. 76 mg, 165 U/mg的过氧化物酶Amano 2) 125单位，再加入0,4%4-氨基安替比林溶液I ML和5%苯酚溶液1.4mL，用Tris-磷酸缓冲液(叫7. 2)稀释至50 ML(随配随用):h)底物溶液:将“一甲基葡萄搪(C,H,406) 2.0g溶解于水50 ML中.用水稀释至100 ML(50C-15可稳定二星期).41，3测定方法4.1.3.1样品溶液的制备用酶制剂配制酶溶液使其0.5 ML的Abs一A。介于。.15和0.32
8、之间:吸取酶制剂1 MLI加到一个适当大小的容量瓶中，用经冷却的水稀释至刻度，混匀。示例:。一葡萄糖转普酶L Amano. n=300稀释1 ml)一300 tnL.4.1.3.2测定吸取底物溶液(4.1.2 h) 1mL和0. 02 mol/L乙酸一乙酸钠缓冲液(pH5.0) (4.1.2c) 1mL加入试管(15 mm X 150 mm)内，在(40土0.5)的恒温水浴箱中保温10 min。加入样品稀释酶液(4.1.3.1) 0.5mL,混匀，于(4010.5)的恒温水浴箱中准确保温60 min后，将试管转移至沸水浴中加热5 min，然后用流水快速冷却。冷却后，吸此溶液0.1 ML到试管中
9、，并加入4-氨基安替比林一苯酚显色剂(4.1.2 g) 3 mL,混匀。将此试管放入(4010.5)的恒温水浴中，保温20 min,测定500 nm处的吸光度A6o。空白对照:吸0. 02 moUL乙酸一乙酸钠缓冲液(pH 5.0) (4.1.2 c) 1mL和样品稀释酶液(4.1.3.1) 0.5mL加入试管(15 mm X 150 mm)内，混匀。将试管转移至沸水浴中加热s min,然后用流水快速冷却。冷却后，加入底物溶液(4.1.2 h) 1mL,混匀。吸此溶液0. 1 ML至空试管(15 mm x 150 mm)内，加入4-氨基安替比林一苯酚显色剂(4.1.2 g) 3 ml,混匀。将
10、此试管放入(4010.5)的恒温水浴中，保温20 min,测定500nm处的吸光度Ao。精确称取105下干燥6h的葡萄糖(C6H,=06) 1.000g,溶于100 ML水中，分别取1 ML,2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL，用水定容至100 ML(每1ML该溶液分别含有100 ,g，200.ug，300 pg，400,ug和500,ug的葡萄糖)。分别吸取以上葡萄糖标准液0.1 ML和4-氨基安替比林一苯酚显色剂(4.1.2 g) 3 mL,加入试管(15mmx15omm)内，馄匀。将这些试管放入(40士0.5)的恒温水浴箱中，保温20min,测定波长500 run处的吸光度As
11、w, As2o, As3o, Asao. Assoa标准液的空白对照:用水来替代葡萄搪标准液，按上述方法测定空白对照液吸光度Aso e4.1.4分析结果的表述在此试验条件下.在反应混合物2.5mL中，60 min产生lpg葡萄搪所需的酶盈定义为一个a-葡萄糖转昔酶活力单位。QB 2525-20014.1.4.1相当于吸光度差为1.000时的葡萄搪的量G (.ug)按式(I)计算.10 20 30 40 50G = ASIO -ASO AS20 - ASOAS30-ASO Asn。一Ago人，。一ASO一54.1.4.2 a-葡萄糖转昔酶活力按式2)计算.a-葡萄糖转昔酶活力(U/ML) =与一
12、儿)XGx(1)2.5 n-x-0.1 0.5式中:A,一样品反应液的吸光度;AO空白溶液的吸光度;G一吸光度差为1.000时，由葡萄搪标准曲线求得的葡萄糖盘，lug，见式(1)02.5反应体系的总容量，nlLc0.1反应体系的取样量，mL:n-酶样品的稀释倍数:0.5一反应体系中酶样品的添加量，ML.4.1.5结果的允许差平行试验相对误差不得超过5%e4.2糖化酶活力的测定4.2.1原理酶作用于淀粉溶液生成还原糖。然后加入费林试剂(4.2.2 f)，在加热的情况下，定量生成氧化亚铜沉淀。在加入碘化钾和硫酸后，生成游离碘，此时，立即用硫代硫酸钠溶液滴定。4.2.2试剂和溶液a) 30%碘化钾溶
13、液:碘化钾150 g溶解于350 mL水，保存在褐色试剂瓶中，避免PH光直射:b) 25%硫酸溶液:硫酸125 g溶于375 mL水:c) 0.05mol/L硫代硫酸钠溶液:将定量分析用的。.1 mol/L硫代硫酸钠母液500 ML用煮沸过的冷却水稀释，所得溶液的总体积为1000 mL。配制好后，应进行标定，求出浓度校正系数f值;d) 1 mol/L乙酸一乙酸钠缓冲溶液(pH4.5):将1 moUL乙酸钠溶液加入到1 mol/L乙酸溶液中，调pH到4.5;e)可溶性淀粉溶液(pH 4.5):将可溶性淀粉(试剂级)在105干燥4h后称量计算含水量。然后，根据可溶性淀粉的含水量称取。. 50 g(
14、折干)的可溶性淀粉，缓慢加入到沸水50 mL中，煮沸5 min，用自来水冷却后，加入1 mol/L乙酸一乙酸钠缓冲溶液5mL，用水定容至100ML;f)费林试剂铜溶液:硫酸铜34.66 g溶解于水中定容至500mL;酒石酸钾钠碱溶液:酒石酸钾钠173 g和氢氧化钠50g溶解于水中，定容至500 ML二一使用前，精确地取等体积的铜溶液和碱液充分混合。4.2.3测定方法4.2.3.1样品溶液的制备OB 2525-2001用水稀释酶样品，使得到酶液的(To一T,)XfX1.62值为3 mg-10mg葡萄糖量。示例:转昔酶:rr=100稀释1 mL-+ 100mLe4.2.3.2测定将可溶性淀粉溶液(
15、4.2.2e)10mL加入到100 mL Erlenmyer三角瓶中，置于40士。.5) C恒温水浴中，预热I0min-15 min。加入样品稀释酶液(4.2.3.1) 1 mL。准确加热30 min后，加入费林试剂(4.2.2 f) 4mL使酶失活。将三角瓶直接在煤气喷灯(或电炉)上加热2 min后，立即放在自来水中冷却。随后，加入30%碘化钾溶液(4.2.2 a) 2 mL和25%硫酸溶液(4,2.26) 2mL，用0. 05 mol/L硫代硫酸钠溶液(4.2.2 0)滴定游离出的碘，以蓝色消失为滴定终点场(ML),空白对照试验:以水取代酶液，在另一个三角瓶中用上述同样的操作步骤测定空白对
16、照值几(ML).临近终点时，加入1%可溶性淀粉溶液应使用可溶性淀粉(试剂级)另行配制1滴-2滴，以蓝色消失作为滴定终点。4.2.4分析结果的表述在此试验条件下，反应30min，反应液中产生相当于10 mg葡萄糖的还原糖所需的酶量，定义为1个糖化酶活力单位。4.2.4.1糖化酶活力按式(3)计算。化酶活力(U/mu =;一:p)x fx1.62x击，式中:兀。一酶反应液滴定消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，mL;To一空白溶液滴定消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，ML;f一一-0.05 moUL硫代硫酸钠溶液浓度的校正系数;1.62-换算系数;1/10一该分析方法的常数(相当于10 mg葡萄糖的还原糖)
17、:n一样品的稀释倍数。4.2.5结果的允许差平行试验相对误差应不超过5%e4. 3 pH的测定按QB/T 1803一1993中pH的试验方法进行测定。4.4砷的测定按GBIT 8450进行测定。4.5铅的测定按GBIT 8449进行测定。4.6重金属的测定按GB/T 8451进行测定。4.7菌落总数的测定按GB 4789.2进行测定。4.8大肠菌群的测定按GB 4789.3进行测定。4.9沙门氏菌检验按GB 4789.4进行测定.OR 2525-20014.10埃希氏菌检验按GB 4789.6进行测定。5检验规则5.1产品应经生产厂质茸检验部门检验合格，并附上合格证后方可包装入库或出厂.5.2
18、生产厂以同一连次生产的且经包装出厂的产品为一批。5.3取样方法成品理化指标分析和微生物指标分析分别采用两种不同的取样方法。5.3.1成品理化指标分析取样从发酵罐中取样，取样前启动搅拌装置.搅拌液体酶至少12h，用温水清洗取样阀，从罐中放出酶液100 ML以冲洗取样阀，再放出酶液80 mL于玻璃瓶中，放入冰箱以备作理化检验用。5.3.2成品微生物指标分析取样从发酵罐中取样，取样前启动搅拌装置，搅拌液体酶至少4h，用温水清洗取样阀，然后用碘液清洗取样阀，从罐中放出酶液100 ML以冲洗掉取样阀的碘液，再放出酶液80 ML于无菌玻璃瓶中，放入冰箱以备作微生物检验用。5.4产品a-葡萄糖转昔酶活力、糖
19、化酶活力、pH、微生物指标为必检项目。砷、铅和重金属为型式检验项目，半年检查一次。如果检验中有一项指标不符合标准要求.应加倍取样，对不合格项目进行复验，如仍不合格，则该批产品判为不合格.5.5当供需双方对产品质量发生异议需要仲裁时，仲裁机构由双方协商选定。仲裁时应按照本标准规定的检验方法进行仲裁分析.6标志、包装、运输、贮存6.1标志产品包装上应贴有牢固的标志，标明生产厂名称、厂址、产品名称、商标、产品型号、批号、生产日期、保质期、产品的主要参数、净含量以及采用的产品标准号，并标有“食品添加剂”字样，并附有产品合格证。6.2包装6.2.1内包装为20L聚乙烯桶。6.2.2外包装为纸箱或200L内涂铁桶两种包装形式。63运输运输过程中应轻装轻卸，不得与有毒、有害和易污染物品混装混运，严防雨淋、曝晒。6.4贮存产品应存放在阴凉干燥的1500.25室内.避免与有毒、有容、易腐、易污染等物品一起存放。6.5保质期在符合规定的贮运条件和包装完整、未开启封口的情况下，保质期为3个月。超过保质期，酶活力可能降低，但仍可使用，使用里应相应增加。
