1、ICS 67.220.20分类号:X69备案号:12497-2003中华人民共和国轻口巳行业标准QB 2583一2003纤维素酶制剂Cellulases2003-09-13发布2003-10-01实施中华人民共和国国家发展和改革委员会发布QB 2583一2003nil胃本标准的第5. 4条为强制性的，其余为推荐性的。本标准参考了联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会的食品添加剂标准纲要第一卷Compendium of Food Additive Specifications, Volume l, Joint FAO/WHO Expert Committee onFood Addi
2、tive (JECFA) 食品工业用酶制剂通则中的“卫生指标”，其一致性程度为非等效。本标准的附录A、附录B、附录C为规范性附录，附录D为资料性附录本标准由中国轻工业联合会提出。本标准由全国食品发酵标准化中心归口。本标准起草单位:中国食品发酵工业研究院、北京宁馨儿生物科技开发有限公司、诺维信中国)生物技术有限公司、中法合资唐山太博尔生物工程有限公司、中国科学院微生物研究所。本标准主要起草人:张蔚、焦志民、李忠兴、翟文景、赵力、刘建军、崔福绵、田栖静。本标准首次发布。QB 2583一2003引言本标准是针对以木霉属为代表的微生物，经发酵、提取制得的纤维素酶制剂。它是一种纤维素酶复合物(纤维素酶系
3、)，在各种酶的协同作用F使纤维素降解，所以，统称为纤维素酶。一般来讲，纤维素酶中的多组分酶系包括外切p-1, 4-葡聚糖酶(Exop-1, 4-glucanase, EC 3. 2. 1. 91)、内切p-1, 4-葡聚糖酶(Endop-1, 4-glucanase, EC3.2. 1.4)和纤维二糖酶(Cellobiase, EC3.2.1.21)不同来源的纤维素酶制剂产品中三种酶组分含量的比例不同，因此其最终的表观酶活力会有差异。考虑到市场上的纤维素酶制剂品种繁多，等级不一，酶活力标示方法各不相同，故制定本标准，以统一国内纤维素酶的测定方法及使用单位，便于使用与交流。产品分类中酸性纤维素酶
4、、中性纤维素酶是按酶制剂在使用时的最适pH划分;而表中的pH系指酶制剂终产品的pH.附录A, B所述方法，是通过测定纤维素酶降解底物生成的还原糖来反映纤维素酶的总酶活力;附录C所述方法，是以标准酶为对照，通过测定底物粘度的降低，得到纤维素酶的相对酶活力(侧重反映纤维素酶的内切酶活力)。生产者和使用者可根据产品的用途选择相应的试验方法。由于犬然纤维素的不溶性、底物结构的多样性，酶系组成、相关浓度和化学结构的不确定性，内切、外切酶的协同作用以及复杂的作用模式，各种终产物的不断形成及反馈控制等因素的影响，因此，若使方法获得较好的重现性和再现性，各实验室严格按照标准规定的底物、pH、反应时间与温度等条
5、件操作是十分重要的。本标准酶活力的测定，参考了IIIPAC. FCC. JECFA推荐的方法以及国内外相关企业标准的测定方法，通过反复试验、验证修改而成。QB 2583一2003纤维素酶制剂范围本标准规定了纤维素酶制剂的术语和定义、要求、试验方法、检验规则和标志、包装、运输、贮存。本标准适用于以木霉属(Trichoderma )为代表的微生物及其变异株，经液体深层发酵或固态培养后，精制提纯制得的酸性(或中性)纤维素酶制剂。主要用于食品、纺织、造纸等工业。食品级纤维素酶制剂也可用作饲料添加剂。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修
6、改单不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 191包装储运图示标志GB/T 4789.2食品卫生微生物学检验菌落总数测定GB/T 4789.3食品卫生微生物学检验大肠菌群测定GB/T 4789.4食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验GB/T 5009. 11食品中总砷的测定方法GB/T 5009.12食品中铅的测定方法GB/T 8451食品添加剂中重金属限量试验法QB/T 1803一1993工业酶制剂通用试验方法QB/T 1804工业酶制剂通用检验规则和标志、包装、运输
7、、贮存JJF 1070定量包装商品净含量计量检验规则国家质量技术监督局【1995第43号令定量包装商品计量监督规定3术语、定义、符号、缩略语下列术语、定义、符号、缩略语适用于本标准。3.1纤维素酶cellulases在各种酶组分的协同作用下，能降解纤维素，使之变成纤维寡糖、纤维二糖和葡萄糖的酶。3.2滤纸酶活力Filter paper activity (FPA)lg固体酶(或imL液体酶)，在(5010.1 C,指定pH条件h(酸性纤维素酶pH4.8，中性纤维素酶pH 6.0), lh水解滤纸底物，产生出相当于l mg葡萄糖的还原糖量，为1个酶活力单位，以u/g(或u/mL)表示。3.3梭甲
8、基纤维素酶活力Sodium carboxymethylcellulose activity (CMCA)还原糖法lg固体酶(或1mL液体酶)，在(5。士。，1) 0C、指定pH条件F(酸性纤维素酶pH 4. 8,中性纤维素酶pH 6.0), lh水解梭甲基纤维素钠底物，产生出相当于1 mg葡萄糖的还原糖量，为1个酶活力单位，以u/g(或u/mL)表示。简写为CMCA-DNS aQB 2583-2003粘度法1g固体酶(或1mL液体酶)，在(40士0.1)0C、指定pH条件下(酸性纤维素酶pH 6. 0，中性纤维素酶pH7.5)，水解c0甲基纤维素钠底物，使底物粘度降低而得到的相对于标准品的纤维
9、素酶相对酶活力。简写为CMCA-VIS o4产品分类4.1按适用pH分为酸性纤维素酶和中性纤维素酶。4.2按产品形态分为固体酶制剂和液体酶制剂两种类型。5要求5.1净含量按国家质量技术监督局19951第43号令执行。5.2外观固体剂型浅灰色或浅黄色，粉状或颗粒状。无霉变、潮解、结块现象，无异味。易溶于水，溶解时允许有少量沉淀物。液体剂型棕色或褐色液体，无异味，允许有少量凝聚物。5.3理化要求理化指标应符合表1的规定。表1纤维素酶的理化指标项目液体剂型固体剂型食品级“工业级b食品级“工业级b总酶活力“u/g(或u/mL)FPA300CMCA-DNS2000CMCA-V S500pH (250C)
10、4.07.0a食品级产品也可用作饲料添加剂。用作饲料添加剂的纤维素酶制剂还应符合其他相关标准法规的要求b工业级产品不得用于食品工业及饲料添加剂(食用酒精和蒸馏酒类除外)。c可根据需要任意标注一种酶活。5，4卫生要求卫生指标应符合表2的规定。表2纤维素酶的卫生指标项目液体剂型固体剂型食品级“工业级“食品级.工业级“，金属(PA Pb计)，mg/kg3030铅，mg/kg55砷，mg/kg33菌落总数，cfu/g -5水105X10大肠菌群，MPN/t 00 g3只103x10沙门氏菌(259样)不得检出不得检出a.6同表IQB 2583一20035.5保质期5.5.1在25以下，固体酶制剂保质期
11、不少于180 d，保质期内酶活力应不低于标示的酶活力5.5.2在25以下，液体酶制剂保质期不少于90d，保质期内酶活力应不低于标示的酶活力。试验方法61净含量按JJF 1070执行。6.2外观取样品log(或ML)，观察、嗅闻，作出判断，做好记录。6.3酶活力6.3.1滤纸酶活力，FPA按附录A方法测定。6.3.2梭甲基纤维素还原糖法)酶活力，CMCA-DNS按附录B方法测定。6.3.3梭甲基纤维素(粘度法)酶活力，CMCA-V IS按附录C方法测定。6. 4 pH按QB/T 1803一1993第9章测定。6.5重金属按GB/T 8451测定。6. 6铅按GB/T 5009.12测定。6. 7
12、砷按GB/T 5009.11测定。6.8菌落总数按GB/T 4789.2测定。6.9大肠菌群按GB/T 4789.3测定。6.10沙门氏菌枯GR/T 4789.4拾骑。检验规则和标志、包装、运输、贮存包装储运图示标志按GB/T 191执行。食品级纤维素酶制剂，应在标签(或质量证明)上标注“食品级”字样。除上述提及条款外，均按QB/T 1804执行。771议73QB 2583一2003附录A(规范性附录)滤纸酶活力(FPA)的测定方法A. 1原理纤维素酶在一定温度和pH条件下，将纤维素底物(滤纸)水解，释放出还原糖。在碱性、煮沸条件下，3,5一二硝基水杨酸(DNS试剂)与还原糖发生显色反应，其颜
13、色的深浅与还原糖(以葡萄糖计)含量成正比。通过在540 run测其吸光度，可得到产生还原糖的量，计算出纤维素酶的滤纸酶活力。以此代表纤维素酶的酶活力。A. 2试剂和溶液除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。A. 2. 1 DNS试剂称取3,5一二硝基水杨酸(1010. 1)g，置于约600 mL水中，逐渐加入氢氧化钠log，在50水浴中(磁力)搅拌溶解，再依次加入酒石酸甲钠200 g、苯酚(重蒸)2g和无水亚硫酸钠5g，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至I OOOmL，过滤。贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7d后使用。A. 2.2柠檬酸缓冲液，0
14、. 05 mol/L pH 4.8(适用于酸性纤维素酶)称取一水柠檬酸4.83 g,溶于约750 mL水中，在搅拌情况下，加入柠檬酸三钠7.94g,用水定容至1000 mL。调节溶液的pH到(4.8士0.05)备用。注:也可采用pH4.8乙酸缓冲溶液:称取三水乙酸钠8. 16 g,溶于约750 ml,水中，加入乙酸2.31 ml,，用水定容至1 000 ML.调节溶液的pH到(4.810.05)备用A. 2.3磷酸缓冲液，0.1 mol/L pH 6. 0(适用于中性纤维素酶)分别称取一水磷酸二氢钠121.0g和二水磷酸氢二钠21.89g，将其溶解在IOL去离子水中。调节溶液的pH到(6.01
15、0.05)备用。溶液在室温F可保存一个月。A.2.4葡萄糖标准贮备溶液(1Omg/mL)称取于(103士2)下烘千至恒重的无水葡萄糖1 g,精确至0. 1 mg，用水溶解并定容至100 mL,A.2.5葡萄糖标准使用溶液分别吸取葡萄糖标准贮备溶液0. 00, 1. 00, 1. 50, 2.00, 2.50, 3.00, 3.50 mL于10 ML容量瓶中，用水定容至10 mL，盖塞，摇匀备用。上述系列浓度应根据需要自行调整。A.2.6快速定性滤纸(杭州新华一号滤纸)沪15 cm(每批滤纸，使用前用标准酶加以校正)。A.3仪器除普通实验室仪器外，还应有:A. 3. 1分光光度计A.3.2酸度计
16、精度10.01 pHA.3.3恒温水浴(50士0.l)0CA. 3.4分析天平感量0.1 mgA_3.5磁力搅拌器A3.6秒表或定时钟A. 3.7沸7k洛(可用800W申炉和高脚烧杯、楠夸量杯或茸楠奔器切成)QB 2583一2003A. 3.8具塞刻度试管25 mLA.4分析步骤A. 4. 1绘制标准曲线按表A. l规定的量，分别吸取葡萄糖标准使用溶液(A.2.5)、缓冲溶液(A.2.2或A.2.3)和DNS试剂(A.2.1)于各管中(每管号平行作3个样)，混匀。将标准管同时置于沸水浴中，反应10 min。取出，迅速冷却至室温，用水定容至25 mL.盖塞，混匀。用10 mm比色杯，在分光光度计
17、波长540 nn处测量吸光度。以葡萄糖量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。线性回归系数应在0.9990以上时方可使用(否则须重做)。表A，1葡萄籍标准曲线管号葡萄糖标准使用溶液缓冲液吸取量mLDNS试剂吸取量ML浓度mg/mL吸取量川工00-Q仪 00203.011.00.50153.021.50.501.53.032.00.501.53.042,50.50之53口53.00.501.53.063.50.50l53.0A.4.2样品的测定A. 4.2. 1待测酶液的制备称取同体酶样1 g,精确至0.1 mg(或吸取液体酶样1 mL，精确至0. 01 mL)，用水溶解，
18、磁力搅拌混匀，准确稀释定容(使试样液与空白液的吸光度之差恰好落在0.3-0.4范围内)，放置10 min，待测。A. 4. 2. 2滤纸条的准备将待用滤纸放入(硅胶)干燥器中平衡24h:将水分平衡后的滤纸制成宽I cm、质量为(5。士。.5)mg的滤纸条，折成M型备用。A. 4.3操作程序取四支25 mL刻度具塞试管(一支空白管，三支样品管)。将折成M型的滤纸条，分别放入每支试管的底部沿l cm方向竖直放入)。分别向四支管中，准确加入相应pH的缓冲溶液(A.2.2或A. 2. 3 )1. 50 mL o分别准确加入稀释好的待测酶液(A.4.2.1)0.50mL于三支样品管中(空白管不加)，使管
19、内溶液浸没滤纸，盖塞。将四支试管同时置于(50士0.1)水浴中，准确计时，反应60 min，取出。立即准确地向各管中加入DNS试剂(A.2.1)3.OmL。再于空白管中准确加入稀释好的待测酶液(A. 4. 2.1) 0. 50 mL,摇匀。将四支管同时放入沸水浴中，加热10 min,取出，迅速冷却至室温，加水定容至25 mL,摇匀。以空白管(对照液)调仪器零点，在分光光度计波长540 run下，用10 mm比色杯，分别测量三支平行管中样液的吸光度。取平均值。以吸光度平均值查标准曲线或用线性回归方程求出还原糖的含量。QB 2583一2003AS结果计算FPA酶活力按式(A. l)计算。戈=Ax
20、l/0.5xn一(A.1)式中:X样品的滤纸酶活力(FPA), u/g(或u/mL );A根据吸光度在标准曲线上查得(或计算出)的还原糖量，mg;1/0.5换算成酶液1 nIL;n酶样的稀释倍数。A.6允许差同一试样两次测试结果的绝对差值，不得超过算术平均值的10 %。变异系数不超过10%eQB 2583一2003附录B(规范性附录)梭甲基纤维素(还原糖法)酶活力(CMCA-DNS )测定方法B. 1原理纤维素酶在一定温度和PH条件下，将纤维素底物(狡甲基纤维素钠)水解，释放出还原糖。在碱性、煮沸条件下，3,5一二硝基水杨酸(DNS试剂)与还原糖发生显色反应，其颜色的深浅与还原糖(以葡萄糖计)
21、含量成正比。通过在540 nm测其吸光度，可得到产生还原糖的量，计算出纤维素酶的CMCA-DNS酶活力。以此代表纤维素酶的酶活力。B.2试剂和溶液除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。B. 2. 1竣甲基纤维素钠(CMC-Na)化学纯(上海光华化学试剂厂)在25C, 2%水溶液，粘度800 mPa s-1200 mPa s o(每批梭甲基纤维素钠使用前用标准酶加以校正)。B. 2.2柠檬酸钠缓冲液，0. 05 mol/L PH 4.8(适用于酸性纤维素酶)称取一水柠檬酸4.83 g,溶于约750 mL水中，在搅拌情况下，加入柠檬酸三钠7.94g，用水定
22、容至1000 mL，调节溶液的PH到(4.8士0.05)备用。注:也可采用pH4.8乙酸缓冲溶液:称取三水乙酸钠8.16 g,溶于约750 mL水中，加入乙酸2.31 mL，用水定容至1000 ML,调节溶液的pH到(4.810.05)备用。B. 2.3磷酸缓冲液，0.1 mol/L PH 6. 0(适用于中性纤维素酶)分别称取一水磷酸二氢钠121.O g和二水磷酸氢二钠21.89g，将其溶解在IOL去离子水中。调节溶液的pH到(6.0士。.05),各用。溶液在室温下可保存一个月。B.2.4 CMC-Na溶液称取2 g CMC-Na,精确至1 mg，缓缓加入相应的缓冲液(B.2.2或B.2.3
23、)约200 mL并加热至80 0C -90 0C，边加热边磁力搅拌，直至CMC-Na全部溶解，冷却后用相应的缓冲液稀释至300 mL，用2 mol/L盐酸或氢氧化钠调节溶液的pH到(4.8士0.05)(酸性纤维素酶)或(6.0士0.05)(中性纤维素酶)，最后定容到300 mL,搅拌均匀，贮存于冰箱中备用。B. 2.5 DNS试剂称取3,5一二硝基水杨酸(1010.1)g，置于约600 mL水中，逐渐加入氢氧化钠log，在50水浴中(磁力)搅拌溶解后，再依次加入酒石酸钾钠200 g、苯酚(重蒸)2g和无水亚硫酸钠5g，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至1000 mL，过滤。贮存于棕色试
24、剂瓶中，于暗处放置7d后使用。B. 2. 6葡萄糖标准贮各溶液(10 mg/mL )称取于(10312)下烘干至恒重的无水葡萄糖1 g,精确至0.1 mg，用水定容至100 mL oB. 2.7葡萄糖标准使用溶液分别吸取葡萄糖标准贮备溶液0. 00. 1. 00. 1. 50. 2.00. 2.50. 3.00. 3.50 mL于l0 ml,容量瓶中，用水定容至10 ML，盖塞，摇匀备用。上述系列浓度应根据需要自行调整。QB 2583一2003B. 3仪器B. 3. 1自动连续多档分配器B.3.2漩涡混合器B. 3. 3试管、水浴等仪器同A.3B. 4分析步骤B. 4. 1绘制标准曲线按表B.
25、1规定的量，分别吸取葡萄糖标准使用溶液(B.2.7)、缓冲溶液(B.2.2或B.2.3)和DNS试剂(B.2.5)于各管中(每管号平行作3个样)，混匀。将标准管同时置于沸水浴中，反应10 min。取出，迅速冷却至室温，用水定容至25 mL，盖塞，混匀。用10 mm比色杯，在分光光度计波长540 nm处测量吸光度。以葡萄糖量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程，线性回归系数应在0.9990以上时方可使用(否则须重做)。表B. 1葡萄糖标准曲线管号葡萄糖标准使用溶液缓冲液吸取量MLDNS试剂吸取量mL浓度mg向IL吸取量ML00.00.002.53.011.00.502.03
26、.021.50.502.03.032.00.502.03.042.50.502.03.053.00.502.03.063.50.502.03.0B. 4. 2样品的测定B. 4. 2. 1待测酶液的制各称取固体酶样1g，精确至0.1 mg(或吸取液体酶样1.OmL,精确至O.OlmL)，用水溶解，准确稀释定容(使试样液与空白液的吸光度之差恰好落在0.330.35范围内)，混匀放置10 min，待测。B. 4.2.2操作程序取四支25 mL亥度具塞试管(一支空白管，三支样品管)。分别向四支管中，准确加入用相应pH缓冲溶液配制的CMC-Na溶液(B.2.4)2.00mLo分别准确加入稀释好的待测酶
27、液(B. 4. 2.1) 0. 50 mL于三支样品管中(空白管不加)，用漩涡混匀器混匀，盖塞。将四支试管同时置于(50+0.1)水浴中，准确计时，反应30 min，取出。迅速、准确地向各管中加入DNS试剂(B.2.5)3.OmL，于空白管中准确加入稀释好的待测酶液(B. 4. 2. 1) 0. 50 mL,摇匀。将四支管同时放入沸水浴中，准确计时，加热10 min，取出，迅速冷却至室温，用水定容至25 mL o以空白管(对照液)调仪器零点，在分光光度计波长540 rim下，用10 mm比色杯，分别测量三支样品管中样液的吸光度，取平均值。通过查标准曲线或用线性回归方程求出还原糖的含量。QB 2
28、583一2003B.5 CMCA-DNS酶活力计算CMCA-DNS酶活力，按式(B.1)计算。戈=Ax1/0.5xnx2，。，(B.1)式中1/0B.6狡甲基纤维素(还原糖法)酶活力(CMCA-DNS), u/g(或u/mL );吸光度在标准曲线上查得(或计算出)的还原糖量，mg;换算成酶液1 ML;酶样的稀释倍数;时间换算系数。Xl月气刀，允许差同一试样两次测试结果的绝对差值，不得超过算术平均值的10%。变异系数不超过5%0QB 2583一2003附录C(规范性附录)梭甲基纤维素(粘度法)酶活力(CMCA-VIS)测定方法C.1原理纤维素酶在一定温度和pH条件下，将梭甲基纤维素钠降解，底物粘
29、度随之降低，粘度的降低与内切纤维素酶活性成正比。通过粘度计测得的数值与指定已知酶活的标准酶样品比较，换算出待测纤维素酶样的相对酶活力(以内切酶活力为主)。C.2试剂和溶液C. 2. 1柠檬酸钠缓冲液，0. 1 mol/L pH6.0(酸性纤维素酶适用)分别称取一水磷酸二氢钠121.O g和二水磷酸氢二钠21.89g，将其溶解在去离子水IOL中。调节溶液的pH到(6.0士0.05)备用。溶液在室温下可保存一个月。C.2.2磷酸缓冲液，0. 1 mol/L pH 7.5(中性纤维素酶适用)分别称取一水磷酸二氢钠22.49g、二水磷酸氢L-钠148.98 g和PEG 6000(聚乙二醇)IO.Og，
30、将其溶解在去离子水IOL中。调节溶液的pH到(7.5士0.05)备用。溶液在室温下可保存一个月。C. 2.3狡甲基纤维素钠(CMC-Na )BLANOSE 7LF(Hercules Incorporated)在250C，取代度65%-90%,2%水溶液，粘度20 mPa - s-50 mPa s oC.2.4 CMC-Na溶液称取35 g CMC-Na，精确至I mg，缓缓加入相应的缓冲液(C.2.1或C.2.2)约700 mL并加热至80 0C -90 0C o边加热边磁力搅拌，直至CMC-Na全部溶解。冷却后用相应的缓冲液(C.2.1或C.2.2)加至950 ml,，用2 mol/L的盐酸
31、或氢氧化钠调节溶液的pH到(6.0士0.05)酸性纤维素酶)或(7.5士0.05)(中性纤维素酶)，最后定容到1 000 mL缓冲液，搅拌均匀，贮存于冰箱中备用。在冰箱中的贮存使用期，最长为3 do使用前应校正pH至相应的范围。C. 2. 5标准酶(酸性或中性)C.3仪器C. 3. 1振荡粘度计MIVI 8004 (Sofraser, France)或同等分析效果的仪器。C. 3.2恒温水浴(50士0.1)0CC. 3. 3漩涡混合器C.3.4 10 mL塑料试管(100mmX 13mm)C. 3.5高精度自动分配器C.3.6秒表C4分析步骤C. 4. 1粘度计的校准使用标准粘度样品校准粘度计
32、。100 mPa s，数值显示在(1800150)mV; lOmPas，数值显示在(750士10) mv.QB 2583一2003C.4.2标准曲线的制备称取一定量的酸性或中性标准酶，用相应的缓冲溶液(C.2.1或C.2.2)溶解，作为标准贮备液。然后将该贮备液梯度按表C.1或表C.2稀释到最终浓度作为酶标准使用溶液备用。酶标准贮备液和使用溶液每日应重新配制。注:表C.1和C. 2中酶标准使用溶液的浓度，应依据所用标准酶的不同而不同。表C.1酸性纤维素酶标准曲线标准点酸性标准品酶活力 p/mL酶标准贮备液 ML柠檬酸钠缓冲液 (C.2.1)10.0000.0加至100 ML20.2705.0加
33、至100 ML30.3787.0加至100 ML40.54010.0加至100 ML50.64812.0加至100 ML60.81015.0加至100 ML71.08020.0加至100 ML表C. 2中性纤维素酶标准曲线标准点中性标准品酶活力 k/mL酶标准贮备液mL磷酸缓冲液(C.2.2)l0.000.0加至l00 ML23.023.0加至100 ML34.034.0加至100 ML45.045.0加至100 ML56.046.0加至100 ML67.057.0加至100 ML710.0710.0加至100 MLC.4.3标准对照酶样的制备称取一定量的标准对照酶样，精确至1 mg，用与溶解
34、相应标准酶同样的缓冲液(C.2.1或C.2.2)溶解。标准对照酶样溶液的浓度，应根据配制的酶标准使用溶液的浓度范围进行调整，使稀释后对照样的酶活恰好落在标准曲线的中部。C.4.4待测酶液的制备称取少量酶样，用相应的缓冲液(C.2.1或C.2.2)溶解，磁力搅拌15 min，并稀释到一定体积，使稀释后样液的酶活恰好落在标准曲线的中部。C.4.5操作程序取若干支专用试管。按表C.3规定，分别吸取各种溶液于各管中(每种样液平行作3个)。每个试管操作间隔应以秒表准确控制相同的时间，按放入顺序依次取出试管，迅速插入振荡粘度计(插入时粘度计切忌碰试管壁)，读数。QB 2583一2003表C. 3实验步骤每
35、个试管加入缓冲液(C. 2. 1或C.2.2)0. 375 mL(空白管0. 500 ml)分别加入酶标准使用溶液(表C. 1或表C. 2),酶标准对照溶液(C.2.4)、样液0. 125 mL依次加入CMC-Na底物，混匀los(漩涡混合器，200r/min)4. 000 ml依次放入40水浴保温30 min振荡粘度计测量体系粘度变化记录读数注1:每做完一个样，振荡棒要擦拭干净。注2:严格控制各管之间的时间C. 5C.5.1结果计算标准曲线的绘制以酶标准使用溶液的酶活力为横坐标，以读取的粘度计读数(mV)为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程，线性回归系数大于。C.5.2 CMCA-VIS
36、酶活力的计算CMCA-VIS酶活力，按式(C. l)9975以上时方可使用(否则须重做)。计算。X,=cxVxnm(C. l)式中:X狡甲基纤维素(粘度法)酶活力(CMCA-VIS), u/g(或u/mL );。通过标准曲线查得(计算出)的酶活力，u/g(或u/mL) ;V容量瓶的体积，ML;n进一步稀释的倍数;m称取(或吸取)样品的量，H(或mL)oC.6允许差同一试样两次测试结果的绝对差值，不得超过算术平均值的10%。变异系数不超过10%aQB 2583一2003附录D(资料性附录)与国际酶活力单位的换算D.1国际纤维素酶活力单位定义在量，为(50士0.1)、相应pH条件下，1 min水解纤维素底物，产生出相当于l lxmol葡萄糖的还原糖1个酶活力单位，以IU/g(或IU/mL)表示。换算公式将附录A或附录B测得的纤维素酶活力单位(mg/h)，按公式(D.1)换算成为国际单位恤mol/min) oX,=凡x 1000180 x 60= 0. 093茂(D.1)国际纤维素酶活力，IU/g(或IU/mL );还原糖的摩尔质量(以葡萄糖计)，g/mol;时间换算系数，s/min;用附录A或附录B测得的纤维素酶活力，u/g(或u/mL) o
