1、8523ICS 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T0169-2010 替代SN016992、SN0133-94和SN/T1059.2-2002 进出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群 和大肠杆菌检验方法 Determination of Coliform, Fecal coliform and Escherichia coli in food for import and export （审定稿） -发布 2011-05-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 SNSN /T 01692010 I 前 言 本标准代替SN 0169-92出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌
2、检验方法、 SN 0133-94出口食品中大肠杆菌（葡萄糖苷酶荧光）检验方法和SN/T 1059.2-2002进出口食品中大肠菌群、大肠杆菌计数滤膜/MUG法进行的整合与修订。 本标准按照 GB/T 1.1-2000 标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写规则，和 SN/T 1949-2007 进出口食品、化妆品检验规程编写基本规则对原标准文本格式、文字表述和文本内容等进行整合与修订，但检验方法与主要技术路线未做改动。本标准与 SN 0169-92、SN 0133-94 和 SN/T 1059.2-2002相比主要变化如下： 1.将原标准名称出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验
3、方法、出口食品中大肠杆菌（葡萄糖苷酶荧光）检验方法和进出口食品中大肠菌群、大肠杆菌计数滤膜/MUG法整合修订为进出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法。 2. SN 0169-92标准的范围不变，但SN 0133-94和SN/T 1059.2-2002标准的范围有限，因此，本标准将1范围整合修订为： 本标准中 MPN 法适用于进出口食品中大肠菌群，粪大肠菌群和大肠杆菌的检验；平板计数法适用于进出口食品中大肠菌群的检验；葡萄糖苷酶荧光法适用于进出口食品（不包括贝类）中大肠杆菌的检验；滤膜/MUG法适用于进出口方便面、膨化食品、矿泉水、饮料、牛奶（需用蛋白酶处理）、单晶糖和椒粒中大肠菌群
4、和大肠杆菌的检验。 3. 增加了规范性引用文件。 4. 增加了术语和定义。 5. 在设备和材料中删掉了乳钵和研棒，稀释瓶中增加了“其他适宜的容器”。 6. 对液体样品MPN法的检测修订为： 液体样品接种量1 mL以上者，用双料月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤；接种量1 mL及1 mL以下者，则用单料月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤。 7. 平板计数法中删去了计算公式。 本标准自实施之日起，SN 0169-92、SN 0133-94和SN/T 1059.2-2002同时废止。 本标准的附录A和附录B是规范性附录。 本标准由中华人民共和国国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛
5、出入境检验检疫局、内蒙古出入境检验检疫局、天津出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：付宝莲、刘中学、侯丽萍、高飞。 本标准系经修订的出入境检验检疫标准。 SN /T 01692010 1 进出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法 1 范围 本标准规定了进出口食品中大肠菌群，粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法。 本标准中 MPN 法适用于进出口食品中大肠菌群，粪大肠菌群和大肠杆菌的检验；平板计数法适用于进出口食品中大肠菌群的检验；葡萄糖苷酶荧光法适用于进出口食品（不包括贝类）中大肠杆菌的检验；滤膜/MUG法适用于进出口方便面、膨化食品、矿泉水、饮料、牛奶（需用蛋白酶处理）、单晶糖和椒粒中大肠
6、菌群和大肠杆菌的检验。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 SN/T 1538.1 培养基制备指南 第1部分：实验室培养基制备质量保证通则 SN/T 1538.2 培养基制备指南 第2部分：培养基性能测试实用指南 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1. 大肠菌群 Coliform 需氧及兼性厌氧，能在37 48h分解乳糖产酸产气的一群革兰氏阴
7、性无芽胞杆菌。 3.2 粪大肠菌群 Fecal coliform 需氧及兼性厌氧、能在44.5 0.5 ，24 h发酵乳糖产酸产气的一群革兰氏阴性无芽胞杆菌，该菌又可称耐热大肠菌群（Thermotolerant coliform organisms）。 3.3 大肠杆菌 Escherichia coli 需氧及兼性厌氧，能在44.5 0.5 48 h分解乳糖产酸产气，生化特征“IMViC”为“+-或-+-”的一群革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌又可称大肠埃希氏菌。 4 检验方法 4.1原理 4.1.1 MPN法 最大可能数(Most Probable Number)是统计学和微生物学结合的一种定量检
8、测法。待测样品经系列稀释并培养后，根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度，应用统计学概率论推算出大肠菌群，粪大肠菌群或大肠杆菌在待测样品中的最大可能数。 4.1.2 平板计数法 大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸，在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色，带有或不带有沉淀环的菌落。 4.1.3 葡萄糖苷酶荧光法 大肠杆菌中的-葡萄糖苷酶可降解培养基中4-甲基伞形酮-D葡萄糖苷酸（MUG），并释放4-甲基伞形酮荧光物质（4-MU），该物质在紫外灯（波长366 nm）下会显现蓝色荧光特点。 4.1.4 滤膜/MUG法 待测样品通过滤膜过滤时，样品中的大肠菌群和大肠杆菌被截留于滤膜表面。将滤膜贴附
9、于LMG或BMA琼脂上培养后，大肠菌群在LMG琼脂上会形成蓝色菌落；而BMA琼脂上的大肠杆菌由于葡萄糖苷降解4-甲基伞形酮-D葡萄糖苷酸（MUG）并释放4-甲基伞形酮，形成紫外光（366 nm）下为蓝白色荧光的菌落。 4.2培养基与试剂 4.2.1 生理盐水：见附录A.1。 SN /T 01692010 2 4.2.2 Butterfield 氏磷酸盐缓冲稀释液：见附录A.2。 4.2.3 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）：见附录A.3。 4.2.4 煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）： 见附录A.4。 4.2.5 大肠杆菌肉汤（EC）： 见附录第A.5。 4.2.6 伊红美蓝琼脂（EMB）：见附
10、录A.6。 4.2.7 结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）： 见附录A.7。 4.2.8 月桂基硫酸盐胰蛋白胨MUG肉汤（LST-MUG）：见附录A.8。 4.2.9 Columbia-MUG：见附录A.9。 4.2.10 蛋白胨-吐温80稀释液（PT）：见附录A.10。 4.2.11 乳糖莫能菌素葡萄糖酸琼脂（LMG）：见附录A.11。 4.2.12 缓冲MUG琼脂（BMA）：见附录A.12。 4.2.13 三（羟甲基）胺甲烷（Tris）缓冲剂：见附录A.13。 4.2.14 营养琼脂斜面：见附录A.14。 4.2.15 色氨酸肉汤：见附录A.15。 4.2.16 MR-VP培养基：见附录A.
11、16。 4.2.17 Korser氏枸椽酸盐肉汤：见附录A.17。 4.2.18 Kovacs氏靛基质试剂：见附录A.18。 4.2.19 甲基红指示剂：见附录A.19。 4.2.20 VP试剂（VP）：见附录A.20。 4.2.21 革兰氏染色液：见附录A.21。 4.2.22 胰蛋白酶贮存液：见附录A.22。 4.3 设备与材料 4.3.1 培养箱：36 1 ，44.5 0.5 。 4.3.2 水浴箱：36 1 ，44.5 0.5 。 4.3.3 冰箱: 0 5 和-15 -20 。 4.3.4 均质器：涡旋式或拍击式。 4.3.5 吸管: 1 mL,具0.1 mL刻度；5 mL和10 m
12、L,具1 mL刻度。 4.3.6 平皿：直径90 mm。 4.3.7 试管：16 mm160 mm。 4.3.8 稀释瓶：三角烧瓶、广口瓶或其他适宜的容器。 4.3.9 玻璃小倒管：长度约20 mm。 4.3.10 天平：感量0.1 g。 4.3.11 显微镜。 4.3.12 菌落计数器。 4.3.13 滤器：备预滤器。 4.3.14 滤膜：有机或水相，孔径0.45 m. 4.3.15 真空泵。 4.3.16 紫外灯：波长366 nm。 4.4 样品制备 4.4.1固体或半固体样品 无菌操作称取样品25 g置于装有225 mL灭菌稀释剂（4.2.1/4.2.2）的适宜容器中，充分振摇、混匀。或
13、将剪碎后的试样25g置于灭菌的均质杯/袋内，加入225 mL灭菌稀释剂，以8 000 r/min 10 000 r/min 涡旋式均质1 min，或以6次9次/s 拍击式均质1 min，制成1：10的样品稀释液备用。 4.4.2 液体样品 SN /T 01692010 3 以无菌吸管吸取样品25 mL置于装有225 mL灭菌稀释剂的适宜容器中，以30 cm幅度于7s内振摇25次或机械振荡器中振摇。制成1：10的样品稀释液备用。 4.4.3 样品稀释 样品稀释液的pH值应在6.57.5之间，pH值过低或过高时可分别用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl予以调节。 根据对样品污染情况的
14、估计，将4.4.1或4.4.2制成的1：10样品稀释液用9 mL灭菌稀释剂进行系列十倍递增稀释，如102，103，104。每一稀释度换用1支1 mL无菌吸管或移液器吸头，上一稀释度用的吸管或吸头不要触及下一稀释度的稀释液。从制备样品稀释液至稀释完毕，全过程不得超过15 min。 4.4.4 样品的酶处理 样品的酶处理可在室温下（23 27 ）进行。 4.4.4.1 固体或半固体样品 无菌操作称取样品25 g置于装有225 mL灭菌PT稀释液（4.2.10）的适宜容器中，充分振摇、混匀。或将剪碎后的试样25g置于灭菌的均质杯/袋内，加入225 mL灭菌稀释剂，以8 000 r/min 10 00
15、0 r/min 涡旋式均质1 min，或以6次9次/s 拍击式均质1min，制成1：10的样品稀释液备用。 4.4.4.2 液体样品 以无菌吸管吸取样品25 mL置于装有225 mL灭菌PT稀释液的适宜容器中，以30 cm幅度于7 s内振摇25次或机械振荡器中振摇。制成1：10的样品稀释液备用。 4.4.4.3 样品稀释 取1：10的酶PT稀释液（胰蛋白酶贮存液：PT稀释液）10 mL于4.4.4.1或4.4.4.2制成的1：10样品稀释液中并混匀，置于36 1 水浴中处理20 min30 min后，将制成的1：10样品酶处理稀释液用9 mL灭菌PT稀释液进行系列十倍递增稀释，如102，103
16、，104。每一稀释度换用1支1 mL无菌吸管或移液器吸头，上一稀释度用的吸管或吸头不要触及下一稀释度的稀释液。从制备样品稀释液至稀释完毕，全过程不得超过45 min。 4.4.4.4 样品过滤 将灭菌过滤装置连接于真空抽滤瓶上，以无菌操作将无菌滤膜放在抽滤底座上并固定。无菌操作加入10 mL20 mL无菌蒸馏水于滤器中，打开真空泵，抽吸过滤，再从4.4.4.3中选取适宜的三个连续稀释度的样品稀释液，每个稀释度分别过滤，每次10 mL。最后再加入10 mL15 mL无菌蒸馏水，抽吸过滤后，关闭真空泵，用无菌镊子将滤膜取出于4.5.3中备用。 4.5 大肠菌群的测定 4.5.1 MPN法 4.5.
17、1.1 从4.4.3中选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液，每个稀释度均接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1 mL。液体样品接种量1 mL以上者，用双料月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤；接种量1 mL及1 mL以下者，则用单料月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤。36 1 培养24 h至48 h后，观察倒管内是否有气泡产生，并记录24 h和48 h内产气的LST肉汤管数。对未产气管有疑问时，可以轻敲试管壁的方式观察是否有较细小的气泡从管底逸出，如所有LST肉汤管均未产气，可按4.8.1报告结果；如LST肉汤管有产气，则按4.5.1.2作证实试验。 4.5.1.2 证实试验：用直径3 mm的接种环
18、从4.5.1.1中所有24 h和48 h内发酵产气的LST肉汤管中分别挑取培养液1环，分别移种于煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，于36 1 培养48 h2 h，记录所有BGLB肉汤管的产气管数，根据BGLB肉汤的产气管数查MPN表（见附录B）并按4.8.1报告结果。 4.5.2 平板计数法 4.5.2.1 从4.4.3中选取适宜的三个连续稀释度的样品稀释液，每个稀释度接种两个灭菌平皿，每皿1 mL。另取1 mL稀释剂加入一灭菌平皿中，作空白对照。将冷至46 的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约15 mL倾注于每个平皿中，小心旋转平皿，使培养基与样液充分混匀。待琼脂凝固后，再加3 mL4 mL
19、的VRBA均匀覆盖于平板表层，凝固后翻转平皿，36 1 培养18 h24 h。 SN /T 01692010 4 4.5.2.2 选取菌落数在25 个250 个之间的平板，计数平板上出现的典型大肠菌群菌落。典型大肠菌群菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径约0.5mm或更大。典型和可疑菌落按4.5.2.3作证实试验。 4.5.2.3 证实试验：用接种环从VRBA平板上挑取10 个不同类型的典型或可疑菌落，移种于BGLB肉汤管内，36 1 培养24 h48 h后观察产气情况。对BGLB肉汤产气者按4.5.2.4计算；对形成菌膜的阳性管则应进行革兰氏染色，以便排除革兰氏阳性杆菌。 4.
20、5.2.4 将4.5.2.3中证实为大肠菌群阳性的菌落数相加，再乘以稀释倍数，按4.8.2报告结果。 4.5.3 滤膜/MUG法 4.5.3.1 以无菌操作将4.4.4.4样品过滤后的滤膜贴放于预先干燥的LMG琼脂平板表面上，滤膜与琼脂表面之间应无气泡。于36 1 培养24 h2 h后，选取菌落数在25 个250 个之间的平板，计数所有蓝色（包括深蓝或浅蓝色）菌落。将滤膜上的菌落数相加，再乘以其稀释倍数，按4.8.4报告结果。 4.6 粪大肠菌群MPN法的测定 用直径为3 mm的接种环从4.5.1.1中所有48 h 2h内发酵产气的LST肉汤管中分别挑取培养液1 环，转种于EC肉汤管中并放置于
21、带盖的44.5 0.5 恒温水浴箱内，培养24 h2 h。水浴箱的水平面应高于肉汤培养基液面。记录EC肉汤管的产气情况，产气管为粪大肠菌群阳性；不产气为粪大肠菌群阴性。根据粪大肠菌群的阳性管数查MPN表（见附录B）并按4.8.1报告结果。 4.7 大肠杆菌的测定 4.7.1 MPN法 4.7.1.1 将4.6中EC肉汤管在44.5 0.5 恒温水浴箱内继续培养24 h2 h后，从产气管中挑取培养液划线接种于伊红美蓝（EMB）平板，36 1 培养24 h2 h。 4.7.1.2 检查平板上有无黑色中心、有光泽或无光泽的可疑菌落。用接种针沾取菌落中心部位并转种于营养琼脂斜面上，36 1 培养18
22、h24 h。 4.7.1.3 将营养琼脂斜面培养物转种于下列生化培养基中进行试验。 4.7.1.3.1 色氨酸肉汤：36 1 培养24 h2 h后，加Kovacs氏试剂0.2 mL0.3 mL，上层出现红色者为靛基质试验阳性。 4.7.1.3.2 MRVP培养基：36 1 培养48 h2 h后，无菌操作移取培养物1 mL至13 mm100 mm试管中，加5萘酚乙醇溶液0.6 mL，40氢氧化钾溶液0.2 mL和少许肌酸结晶，振摇试管后静置2 h，如出现伊红色，为VP试验阳性。将MRVP培养物的剩余部分继续培养48 h后滴加5 滴甲基红溶液，如培养物变红则表示甲基红试验阳性；若变黄则甲基红试验阴
23、性。 4.7.1.3.3 Kovser氏枸椽酸盐肉汤：36 1 培养96 h后，观察其生长情况。 4.7.1.3.4 LST肉汤：36 1 培养48 h2 h后，观察其产气情况。 4.7.1.3.5 革兰氏染色：取营养琼脂斜面培养物进行革兰氏染色。大肠杆菌为革兰氏阴性无芽胞杆菌。 4.7.1.3.6 大肠杆菌和非大肠杆菌生化鉴别如下： 靛基质 MR VP 枸椽酸盐 鉴定(型别) 典型大肠杆菌 非典型大肠杆菌 典型中间型 非典型中间型 典型产气肠杆菌 非典型产气肠杆菌 如出现表中以外的生化反应类型,表明培养物可能不纯,应重新划线分离,必要时做重复试验。 SN /T 01692010 5 4.7.
24、1.3.7 大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌,发酵乳糖产酸产气,IMViC试验为 或。根据LST肉汤阳性管数查MPN表并按4.8.1报告结果。 4.7.2 葡萄糖苷酶荧光法 4.7.2.1 从4.4.3中选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液，每个稀释度均接种三管LST-MUG 肉汤，每管1 mL。于30 min内置于36 1 水浴或培养箱内培养24 h2 h。将培养后的LST-MUG 肉汤管拿至暗室，在长波紫外光灯（波长366 nm）下观察。产气显蓝色荧光的为大肠杆菌阳性；产气不显蓝色荧光的按4.7.2.2作证实试验。 4.7.2.2 证实试验：从4.7.2.1中产气不显蓝色荧光的LST-MUG
25、 肉汤管中挑取培养物，划线接种于Columbia-MUG 琼脂平板，于36 1 培养24 h2 h。将培养后的Columbia-MUG平板拿至暗室，在长波紫外光灯（波长366 nm）下观察，凡显蓝色荧光的菌落均为大肠杆菌阳性菌落。 4.7.2.3 根据4.7.2.1中LST-MUG肉汤阳性管数，和4.7.2.2中Columbia-MUG琼脂平板证实为大肠杆菌阳性的LST-MUG肉汤阳性管数查MPN表，并按4.8.3报告结果。 4.7.3 滤膜/MUG法 4.7.3.1 以无菌操作将4.4.4.4样品过滤后的滤膜贴放于预先干燥的BMA琼脂平板表面上，滤膜与琼脂表面之间应无气泡。放入36 1 培养
26、箱中培养24 h2 h，在暗室或紫外操作室内用波长366 nm UV灯观察滤膜上的菌落是否有蓝白色荧光。选用菌落数范围在25 个250 个之间的平板，计算蓝白色荧光的菌落数并相加，再乘以其稀释倍数后，按4.8.4报告结果。 4.8 报告结果 4.8.1 MPN法 每克（毫升）样品中大肠菌群、粪大肠菌群或大肠杆菌的MPN值（MPN/g,mL）。 4.8.2 平板计数法 每克（毫升）样品中大肠菌群数（cfu/g,mL）。 4.8.3 葡萄糖苷酶荧光法 每克（毫升）样品中大肠杆菌的MPN值（MPN/g,mL）。 4.8.4 滤膜/MUG法 每克（毫升）样品中大肠菌群或大肠杆菌数（cfu/g,mL）。
27、 SN /T 01692010 6 附录A （规范性附录） 培养基与试剂 为保证培养基的质量，应按SN/T 1538.1培养基制备指南 第1部分：实验室培养基制备质量保证通则和SN/T 1538.2 培养基制备指南 第2部分：培养基性能测试实用指南 进行培养基的制备与性能测试。若使用商售的脱水合成培养基，应选用通过 ISO 9000 质量体系认证的国内外生产厂商的产品并按其说明进行制备和使用。 A.1 生理盐水 氯化钠 8.5 g 蒸馏水 1000.0 mL 将氯化钠溶于蒸馏水中,121 高压灭菌15 min。 A.2 Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液 贮存液 磷酸二氢钾(KH2PO4
28、) 34.0 g 蒸馏水 500 mL 将磷酸二氢钾溶于蒸馏水中,用1 mol/L氢氧化钠约175 mL调至pH 7.2。用蒸馏水加至1000 mL贮存于冰箱。 稀释液 取贮存液1.25 mL, 用蒸馏水稀释至1000 mL,分装于合适的容器后,121 高压灭菌15 min。 A.3月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(LST) 胰蛋白胨或胰酪胨(Trypticase) 20 g 氯化钠 5.0 g 乳糖 5.0 g 磷酸氢二钾(K2HPO4) 2.75 g 磷酸二氢钾(KH2PO4) 2.75 g 月桂基硫酸钠 0.1 g 蒸馏水 1000.0 mL 将各成分溶解于蒸馏水中。分装到有倒立发酵管的20 m
29、m150 mm试管中,每管10 mL。121 高压灭菌15 min。最终pH 6.80.2。双料培养基除蒸馏水不变外，其余成分加倍。 A.4煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB) 蛋白胨 10.0 g 乳糖 10.0 g 牛胆粉(oxgall或oxbile)溶液 200.0 mL 0.1煌绿水溶液 13.3 mL 蒸馏水 1000.0 mL 将蛋白胨乳糖溶于约500 mL蒸馏水中,加入牛胆粉溶液200 mL(将20.0g脱水牛胆粉溶于200 mL蒸馏水中),用蒸馏水稀释到975 mL,调pH7.4。再加入0.1煌绿水溶液13.3 mL,用蒸馏水补足到1000 mL,用棉花过滤后,分装到20 mm150
30、mm试管(管内有倒立的小发酵管)中,每管10 mL。121 高压灭菌15 min。最终pH 7.2 0.1。 A.5 EC肉汤 SN /T 01692010 7 胰蛋白胨或胰酪胨 20.0 g 3号胆盐或混合胆盐 1.5 g 乳糖 5.0 g 磷酸氢二钾(K2HPO4) 4.0 g 磷酸二氢钾(KH2PO4) 1.5 g 氯化钠 5.0 g 蒸馏水 1000.0 mL 将以上成分溶解于蒸馏水中,分装16 mm150 mm试管(管内有倒立的小发酵管),每管8 mL。121 高压灭菌15 min,最终pH 6.90.1。 A.6伊红美蓝琼脂(EMB) 蛋白胨 10.0 g 乳糖 10.0 g 磷酸
31、氢二钾(K2HPO4) 2.0 g 琼脂 15.0 g 伊红(水溶性) 0.4 g或2水溶液20 mL 美蓝 0. 065 g或0.5水溶液13 mL 蒸馏水 1000.0 mL 在 1000 mL 蒸馏水中煮沸溶解蛋白胨、磷酸盐和琼脂,加水补足至原量。分装于三角烧瓶中。每瓶100 mL或200mL, 121 高压灭菌15 min。最终pH 7.10.2。使用前将琼脂融化,于每100 mL琼脂中加5 mL灭菌的20乳糖水溶液、2 mL2伊红水溶液和1.3 mL0.5美蓝水溶液,摇匀,冷至45 50 倾注平皿。 A.7 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA) 蛋白胨 7.0 g 酵母膏 3.0 g 乳
32、糖 10.0 g 氯化钠 5.0 g 胆盐或3号胆盐 1.5 g 中性红 0.03 g 结晶紫 0.002 g 琼脂 15 g18 g 蒸馏水 1000.0 mL 无需高压灭菌。将上述成分溶于蒸馏水中,静置几分钟,充分搅拌,调至 pH 7.40.1。煮沸 2 min,将培养基冷至45 50 倾注平板。临用时制备,不得超过3 h。 A.8 LST-MUG肉汤 胰蛋白胨或胰酪胨 20.0 g 氯化钠 5.0 g 乳糖 5.0 g 磷酸氢二钾(K2HPO4) 2.75 g 磷酸二氢钾(KH2PO4) 2.75 g 月桂基硫酸钠 0.1 g MUG 0.1 g 蒸馏水 1000.0 mL SN /T
33、01692010 8 将各成分溶于蒸馏水中,分装试管(内装倒立小发酵管)，每管 10 mL。121 高压灭菌15 min。最终pH 6.80.2。 A.9 Columbia-MUG琼脂培养基 胰酪胨 13.0 g 水解蛋白 6.0 g 酵母浸膏 3.0 g 牛肉浸膏 3.0 g 可溶性淀粉 1.0 g 氯化钠 5.0 g 琼脂 13.0 g 蒸馏水 1000.0 mL 将各成分溶于水中，无须调pH值。121 高压灭菌15 min 。冷却至55 60 ，倾注平板。 A.10 蛋白胨-吐温80稀释液(PT) 蛋白胨 1.0 g 吐温80 10.0 g 蒸馏水 1000.0 mL 将上述成分加热溶解
34、分装90 mL于三角瓶中,121 高压灭菌15 min。 A.11 乳糖莫能霉素葡萄糖醛酸琼脂（LMG） 胰蛋白胨 10.0 g 蛋白胨 5.0 g 酵母膏 3.0 g 乳糖 12.5 g 莫能霉素 0.038 g（于95酒精10 mL溶解） 苯胺蓝 0.1 g 葡萄糖醛酸钠盐 0.5 g 硫酸十七烷基钠盐 0.25 mL 琼脂 15 g 蒸馏水 1000.0 mL 无需高压灭菌。加热煮沸，温度冷至45 50 无菌操作，调整pH最终为7.20.1。倾注平板，打开皿盖在35 1 温箱，15 min20 min烘干备用。 A.12 缓冲MUG琼脂（BMA） 磷酸氢二钠(Na2HPO4) 8.23
35、g 磷酸二氢钠(NaH2PO4) 1.20 g 4甲基伞形酮D葡萄糖苷酸（MUG）0.1 g 琼脂 15.0 g 蒸馏水 1000.0 mL 溶解加热煮沸，调整pH 7.27.6，121 高压灭菌15 min。温度冷至45 50 ，倾注平板。 A.13 Tris缓冲剂（1.0mol/L） 溶解121.1 g 三（羧甲基）胺甲烷于 500 mL水中，用浓盐酸调节溶液至所需pH值。用水稀释至1 L。于 4 6 保存。 SN /T 01692010 9 A.14 营养琼脂斜面 牛肉膏 3.0 g 蛋白胨 5.0 g 琼脂 15.0 g 蒸馏水 1000.0 mL 将各成分于蒸馏水中煮沸溶解。分装合适
36、的试管。121 高压灭菌15 min。最终pH 7.30.1。灭菌后摆成斜面备用。 A.15色氨酸肉汤 胰胨或胰酪胨 10.0 g 蒸馏水 1000.0 mL 加热搅拌溶解胰胨或胰酪胨于蒸馏水中。分装试管,每管 5 mL。121 高压灭菌 15 min。最终 pH 6.90.2。 A.16 MR-VP培养基 眎胨 7.0 g 葡萄糖 5.0 g 磷酸氢二钾(K2HPO4) 5.0 g 蒸馏水 1000.0 mL 将各成分溶于蒸馏水中,分装试管,121 高压灭菌15 min,最终pH 6.90.2。 A.17 Koser氏枸椽酸盐肉汤 磷酸氢铵钠(NaNH4HPO44H2O) 1.5 g 磷酸氢
37、二钾(K2HPO4) 1.0 g 硫酸镁(MgSO47H2O) 0.2 g 枸椽酸钠(含2H2O) 3.0 g 蒸馏水 1000.0 mL 将各成分溶解于蒸馏水中,分装试管,每管10 mL,121 高压灭菌15 min。最终pH 6.70.2。 A.18 Kovacs氏靛基质试剂 对二甲氨基苯甲醛 5.0 g 戊醇 75.0 mL 盐酸(浓) 25.0 mL 将对二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中,然后慢慢加入浓盐酸即可。 A.19 甲基红指示剂 甲基红 0.1 g 95乙醇 300 mL 将甲基红溶解于300 mL乙醇中,加水稀释至500 mL。 A.20 Voges-Pros kauer(V-P)试
38、剂 甲液 -萘酚 5.0 g 无水乙醇 100.0 mL SN /T 01692010 10 乙液 氢氧化钾 40.0 g 用蒸馏水加至 100.0 mL。 A.21 革兰氏染色液 结晶紫染色液 结晶紫 1.0 g 95乙醇 20.0 mL 1草酸铵水溶液 80.0 mL 将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。 革兰氏碘液 碘 1.0 g 碘化钾 2.0 g 蒸馏水 300.0 mL 将碘与碘化钾先行混合,加入蒸馏水少许充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300 mL。 沙黄复染液 沙黄 0.25 g 95乙醇 10.0 mL 蒸馏水 90.0 mL 将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水
39、稀释。 染色步骤 a. 将涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染液1 min后水洗。 b. 滴加革兰氏碘液作用1 min后水洗。 c. 滴加95乙醇脱色约15 s30 s，直至染色液被洗掉,但不要过分脱色,水洗。 d. 滴加复染液复染1 min后水洗、待干、镜检。 结果：革兰氏阳性菌呈紫色,革兰氏阴性菌呈红色。 A.22 胰蛋白酶贮存液 用Tris缓冲稀释剂10 g胰蛋白酶（Doifco No.0153或等效品）至100 mL， pH7.6.如需要加热至35 以助溶，通过滤纸（Whatman No.1或等效品）过滤以除去不溶物质，再用0.45 m滤膜过滤除菌。于4 6 保存一周或18 保存3个月。 SN /T 01692010 11 附 录 B （规范性附录） 1g(mL)检样中最大可能数（MPN）表 采用三管法，接种量分别为0.1 g(mL)、0.01 g(mL)、0.001 g(mL)。 阳性管数 95%置信区间 阳性管数 95%置信区间 0.10 0.01 0.001 MPN 低 高 0.10 0.01 0.001 MPN 低 高 0 0 0 1100 420 - 注1： 本表采用3个稀释度（0.1 g
