1、进出口食品中大 肠菌群、大肠杆菌计数滤膜/MUG法 Total coliform and escherichia coli counts in food for import andexport Membrane filter/MUG method SN/T1059.2 2002 前 言 本标准是按照GB/T 1.1 1993标准化工作导则第1单元：标准的起草与表述规则第1部分：标准编写的基本规定进行编写的。其中大肠菌群、大肠杆菌计数滤膜/MUG法的培养基、培养温度和滤膜法等内容，是参考美国公职分析化学家协会(AOAC)公定分析方法(1995年第16版17.3.09)，结合SN 0169 19
2、92出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法中样品制备并在实验的基础上编写的。 本标准的附录A是标准的附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准由中华人民共和国天津出入境检验检疫局负责起草。 本标准起草人：陈子红、侯丽萍、唐丹舟、张思传、孙俐。 本标准首次发布。 1 范围 本标准规定了进出口食品中大肠菌群、大肠杆菌计数滤膜/MUG法。 本标准仅适用于进出口方便面、膨化食品、矿泉水、单晶糖、饮料、椒粒、牛奶(需用蛋白酶处理)中大肠菌群、大肠杆菌的计数滤膜/MUG法检验。 2 引用标准 下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本
3、均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。 SN 0330 1994出口食品中微生物学检验通则 3 抽样 按SN 0330规定执行。 4 检验方法 4.1 方法原理 将滤膜放入滤器，过滤样品，由于滤膜的作用，大肠菌群、大肠杆菌保留在膜表面。大肠菌群在乳糖莫能霉素葡萄糖醛酸(LMG)琼脂平板上经培养后产生蓝色菌落。大肠杆菌经培养后产生的葡萄糖苷能降解荧光底物4 甲基伞形酮 D葡萄糖苷酸(MUG)并释放4 甲基伞形酮荧光物质，在波长366 nm长波紫外光(UV)灯下MUG阳性菌落呈蓝白色荧光。 4.2 设备和材料 4.2.1 滤器：一套，备有预滤器。 4.2
4、.2 真空泵。 4.2.3 长波紫外光(UV)灯：波长366 nm。 4.2.4 滤膜：有机或水相，孔径0.45 m。 4.2.5 培养箱：36 1。 4.2.6 水浴箱：45 1。 4.2.7 吸管：1mL、10mL，具刻度。 4.2.8 玻璃三角瓶和广口瓶：500mL。 4.2.9 试管：17 mm 170 mm，玻璃制。 4.2.10 玻璃珠：直径5 mm。 4.2.11 平皿：直径90 mm。 4.2.12 天平：感量0.1 g。 4.2.13 均质器。 4.2.14 乳钵和研棒。 4.3 培养基和试剂 4.3.1 蛋白胨-吐温80(PT)稀释液(见附录A A1)。 4.3.2 乳糖莫
5、能霉素葡萄糖酸琼脂(LMG)(见附录A A2)。 4.3.3 缓冲MUG琼脂(BMA)(见附录A A3)。 4.3.4 三(羟甲基)胺甲烷(Tris)缓冲剂(见附录A A4)。 4.3.5 胰蛋白酶贮存液(见附录A A5)。 4.4 样品制备 4.4.1 以无菌操作取有代表性的样品。如有包装则用75%乙醇在开口处擦拭后取样。若不能及时检验，应将冷冻样品置于-15保存；非冷冻而易腐的食品，应置于4冰箱保存。检验前冷冻样品可于2518 h内解冻，或在45以下15 min内解冻。 4.4.2 样品匀液的制备 4.4.2.1 液体食品 以灭菌吸管吸取25mL样品，放入装有225mL PT稀释液的500
6、mL灭菌广口瓶(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，以80 cm幅度、于7 s内振摇25次(或以机械振荡器振摇)，制成110的样品匀液。 4.4.2.2 固体和半固体食品 以无菌操作取25 g样品，放入装有225mL PT稀释液的灭菌均质杯内，于8 000 r/min均质1 min2 min ，制成110样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。 4.4.3 稀释样品匀液 根据对样品污染情况的估计，用PT稀释液将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液，如10、 。从制备样品匀液至稀释完毕，全过程不得超过15 min。 4.4.4 需要酶处理的食品 取110 PT稀释液10mL加酶原液1mL，在灭菌试管
7、中混合放入36 1水浴中处理 20 min30 min ，取出过滤。 4.5 过滤 对每一份试样，选用适宜的三个连续稀释度的样液，每个稀释度的样液分别过滤两次，将灭菌的过滤装置连接于真空抽滤瓶上，以无菌操作将无菌滤膜放在抽滤底座上，用不锈钢夹子固定。以无菌操作加10mL20mL无菌蒸馏水于滤器中，加入PT样品匀液10mL，打开真空泵，抽吸过滤，再加入10mL15mL 无菌蒸馏水，抽吸过滤，关闭真空泵。用无菌镊子将滤膜取出。 4.6 计数 4.6.1 大肠菌群计数 以无菌操作将滤膜取出放于预先干燥的LMG琼脂平板表面上，滤膜与琼脂表面之间应无气泡。放入36 1培养箱培养24 h 2 h。选用25
8、250个菌落的平板，计数所有蓝色(包括深或浅蓝色)的菌落。滤膜上的菌落数乘以稀释倍数即为每克(毫升)g(m)食品中大肠菌群数。 4.6.2 大肠杆菌计数 将有大肠菌群的滤膜放入预先干燥好的BMA琼脂平板表面上，滤膜与琼脂表面之间应无气泡。放入36 1培养箱培养2 h，在暗室或紫外操作室内用波长366 nm UV灯观察滤膜上的菌落是否有蓝白色荧光。选用25250个菌落数的平板，计算所有带蓝白色荧光的菌落数，乘以稀释倍数即为每克(毫升)g(mL)食品中大肠杆菌数。 附录A (标准的附录) 培养基和试剂 A1 蛋白胨-吐温80(PT)稀释液 将上述成分加热溶解分装90mL于三角瓶中，121，15 m
9、in高压灭菌。 A2 乳糖莫能霉素葡萄糖醛酸琼脂(LMG) 加热煮沸，不能高压消毒，温度冷至4550无菌操作，调整pH最终为7.2 0.1。倾注平板，打开皿盖在35温箱，15 min20 min烘干备用。 A3 缓冲MUG琼脂(BMA) 溶解加热煮沸，调整pH7.27.6，121，15 min高压灭菌。温度冷至4550，倾注平板。 A4 Tris缓冲剂(1.0 mol/L)。溶解121.1 g三(羟甲基)胺甲烷于500mL水中，用浓盐酸调节溶液至所需pH值。用水稀释至1 L。室温46保存。 A5 胰蛋白酶贮存液：用Tris缓冲剂稀释10 g胰蛋白酶(Doifco No.0153或等效品)至10
10、0mL，pH7.6。如需要加热至35以助溶，通过Whatman No.1滤纸(或等效品)过滤以除去不溶物质，再用0.45m滤膜过滤除菌。于46保存一周或-18保存3个月。 a) 蛋白胨 1.0 gb) 吐温80 10.0 gc) 蒸馏水 1 000mLa) 胰蛋白胨 10.0 gb) 蛋白胨 5.0 gc) 酵母膏 3.0 gd) 乳糖 12.5 ge) 莫能霉素 0.038 g(溶解在10mL 95%酒精里) f) 苯胺蓝 0.1 gg) 葡萄糖醛酸钠盐 0.5 gh) 硫酸十七烷基钠盐 0.25mLi) 琼脂 15 gj) 蒸馏水 1 000mLa) 磷酸氢二钠 8.23 gb) 磷酸二氢钠 1.20 gc) 氯化钠 5.0 gd) 4-甲基伞形酮-D-葡萄糖苷酸(MUG) 0.1 ge) 琼脂 15.0 gf) 蒸馏水 1 000mL
