1、SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1152-2002鲤春病毒血症病毒(SVCV)逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR )检测方法Test method of reverse transcription polymerase chainreaction (RT-PCR) for spring viraemia of carp virus (SVCV )2002-11-25发布2003-05-01实施中华人民共和匡国家质量监督检验检疫总辰SN/T 1152-2002nil吕本标准是在总结我国在这一领域的实践经验并参考国际上有关检测规程的基础上制定的。本标准的附录A是资料性附录。本标
2、准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本标准主要起草人:江育林、高隆英、刘羞、史秀杰。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。SN/T 1152-2002鲤春病毒血症病毒【SVCV)逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR )检测方法范围本标准规定了细胞分离病毒后，用PCR技术诊断Svc病毒的方法。本标准适用于Svc病毒的分离和鉴定，适用于本病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标
3、准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682-1992分析实验室用水规格和试验方法(eqv ISO 3696:1987)GB/T 18088-2000出人境动物检疫采样试荆和材料3.1水应符合GB/T 6682-1992中一级水的规格。用于PCR(包括核酸抽提)时所用的水要用DEPC处理以除掉RNA酶。3.2 SVC病毒标准株3. 3 Taq酶一20保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。3.4逆转录酶AMV10 U/mL。一20保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。3.5 RNA抑制剂(RNasin)40 U/pL。-20保存，不
4、要反复冻融或温度剧烈变化。3. 6 dNTP(含dCTP, dGTP , dATP, dTTP各10 mmoL/L)3.7引物该试验选用Svc病毒的糖蛋白基因作为PCR的模板。该基因长1 588 by，在这里用了2对引物:F1和R2扩增该基因中的714 by片断，而Fl和R4则从该片断中再扩增606 by片断。所以实际上是“半嵌套式”的PCR(semi-nested PCR)。使用时浓度为40 pmol/L。其序列如下:R2:5-AGA TGG TAT GGA CCC CAA TAC ATH CAN CAY-3R4:5-CTG GGG TTT CCN CCT CAA AGY TGY-3Fl :
5、5-TCT TGG AGC CAA ATA GCT CAR RTC-3SN/T 1152-20023.8无水乙醇分析纯，使用前预冷到一20C.3.9矿物油要求无DNA酶和RNA酶.4器材和设备4.1 96孔细胞培养板4.2倒置显微镜4.3恒温培养箱4.4普通冰箱和低温冰箱4.5组织研磨器46离心机和离心管4.7 PCR扩增仪4.8电泳仪4.9微量移液器及吸头4.10紫外观察灯5 SVC病毒的分离5.1采样对有临床症状的鱼，如是体长小于等于4 cm的鱼苗取整条鱼，体长4 cm-6 cm的鱼苗取内脏(包括肾);体长大干6 cm的鱼则取脑、肝、肾、脾。而对无症状的鱼要取肾、脾、鳃和脑组织，成熟雌鱼还
6、需取卵巢液。按GB/T 18088-2000采样。5.2样品处理应在10以下。先用组织研磨器将样品匀浆成糊状，再按1:10的最终稀释度重悬于培养液中.如果在匀浆前未用抗菌素处理过样品，则须将样品匀浆后再悬浮于含有1 000 TU/mL青霉素和1 000 pg/mL链霉素的培养液中，于15C下孵育2h-4h或4下孵育6 h-24 h, 7 000 r/min离心15 min，收集上清液。卵巢液也要用上述浓度的抗菌素处理以防污染。不必匀浆但需稀释2倍以上。用相同的方法离心卵巢液样品并在以后的步骤中直接用其上清液。5.3病毒分离对1:10的组织匀浆上清液再作两次10倍稀释，然后将这1:10,1:10
7、0和1:1 000 3个稀释度的上清液以适当体积分别接种到生长约24 h的EPC,CO或者FHM细胞单层中，每孔(2 cm)的细胞单层最多接种100 tL稀释液。15C-20吸附。5h-lh后，加人细胞培养液。置于18士2培养。试验中要有2孔阳性对照(接种SVC标准株)，和空白对照(未接种病毒的细胞)。阳性对照和待测样品都接种细胞后，7d内每天用40倍到100倍倒置显微镜检查。空白对照细胞应当正常。如果接种了被检匀浆上清稀释液的细胞培养中出现细胞病变(CPE)，应立即进行鉴定。如果除阳性对照细胞外，没有CPE出现，则在培养7d后还要用敏感细胞进行再传代培养。传代时，将接种了组织匀浆上清稀释液的
8、细胞单层培养物冻融一次，以7。r/min, 4C离心15 min，收集上清液将上清液接种到新鲜细胞单层，培养7d。每天用40倍到100倍倒置显微镜检查。如果阳性对照也未出现CPE，则必须换用敏感细胞和一批新的组织样品重新进行另一系列的病毒学检查。SN/T 1152-20026 SVC病毒的鉴定6.1样品处理将450川细胞病变悬液放人1. 5 MI的离心管，再加人450川一CTAB溶液(见附录A.1)并混匀，25作用2 h,6.ZRNA抽提在含有样品的塑料离心管中加人600 IeL抽提液2(见附录A. 3 )，用力混合至少30 s,12 000 r/min离心5 min，小心取上层水相(约800
9、 ItL)，再加人700 IaL抽提液1(见附录A. 2 )，用力混合至少30 s, 12 000 r/min离心5 min，小心取上层水相约600沙)。再加人一20预冷的1.5倍体积的无水乙醉(约900 pL)，倒置数次混匀后，-20C 8 h以上沉淀核酸。12 000 r/min离心30 min，小心弃去上清。干澡后加10 pL水溶解，用作PCR模板。6.3变性和退火在PCR管中加人10 ML模板和2.5 pL引物R2，加2. 5 pL水使总体积为15 pL,置于70反应5 min。立即冰浴，低速离心约5s，使液体集中在底部。6. 4 cDNA合成在上述反应管中继续加人:5 PL的5倍逆转
10、录酶浓缩缓冲液(见附录A. 5),2 pL dNTP,O. 5 ;ALRNA酶抑制剂(20 U),1 pI逆转录酶AMV(10 U)和1. 5 PI水口6. 5 PCR扩增DNA在上述反应管中再继续加人:10倍Taq酶用浓缩缓冲液(见附录A. 7)8 pL,25 mmol/L的氯化镁(见附录A. 6)8 pl.,dNTP 2 pI、引物R22p1和引物Fl 2 pL,Taq酶5U、加水到总体积为100 pL,每管加入50醉，矿物油。短时间低速离心让矿物油集中在上层。再将反应管置于PCR扩增仪。先94C 4 min-50C 1 min -72C 1 min，再94C 1 min-501 min
11、-720C 1 min, 30次循环，然后72 C8 min,最后4 *C保温。66琼脂糖电泳用TBE电泳缓冲液(见附录A. 4 )配制2写的琼脂糖(含。. 5 pg/mL EB见附录A. 8 )平板。将平板放人水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面将6pL样品和2 PL样品缓冲液(见附录A. 9 )混匀后加人样品孔。在电泳时设立DNA标准分子量作对照，推荐使用pUC19 DNA/Msp(Hpall), 5 V/cm电泳约。，5卜，当浪酚蓝到达底部时停止。在紫外灯下观察核酸带并判断结果。6.7嵌套式PCR如果PCR后产物电泳时看不到DNA带，取5 pL产物做模板;如果PCR后产物电泳时能看到DN
12、A带，只是要求进一步核实，则需将产物按1 , 1 000稀释后取5醉做模板。然后依次加人以下试剂Taq酶5 U,dNTP 2 pL，引物R4 2.5 pL和引物Fl 2.5 pL,10倍用浓缩的Taq酶缓冲液10 pL,25 mmol/L的MgCl, 10 pL、加水到总体积为100 pLa每管加人50 ML矿物油短时间低速离心让矿物油集中在上层。再将反应管置于PCR扩增仪.先94C 4 min-50C 1 min -72C 1 min，再94C 1 min-50 C 1 min -72C 1 min, 30次循环，然后72C 8 min，最后4C保温。6.8设立对照6. 8. 1在6.1样品
13、处理过程中必须设立阳性对照、阴性对照和空白对照，6.8.2取含有已知SVC病毒标准株的细胞悬液作为阳性对照。68.3取正常的细胞悬液作为阴性对照。6.8.4 W%休VN水代替模板作为空白对照.SN/T 1152-20027结果判定样品经过接种细胞和盲传后均没有CPE出现，则结果判为阴性。有CPE出现，则要用FUR万沃进行鉴定是否由SVC病毒引起。PCR后阳性对照会出现一条714 by的DNA片段。阴性对照和空白对照没有该核酸带。嵌套式PCR后阳性对照会出现一条606 by的DNA片段。阴性对照和空白对照均没有该核酸带。待测样品PCR扩增后能在相应714 by DNA位置上有带，或者嵌套式PCR
14、扩增后能在相应606 by位置上有带，均可判为阳性。无带或带的大小不是714 by或606 by的均判为阴性。SN/T 1152-2002附录A(资料性附录)试剂配制A.1CTAB溶液按CTAB 2%,氯化钠1.4 mol/L,EDTA 20 mmol/L,Tris-HCI 20 mmol/L pH=7. 5配制。用前加琉基乙醇至终浓度为。.2500,A. 2抽提液1将三氯甲烷/异戊醇按24: 1的比例混合，密闭避光保存。A. 3抽提液21 mol/l. Tris水溶液饱和的酚，三氯甲烷，异戊醇=2524: 1混合，密闭避光保存。A.4 TBE电泳缓冲液(5倍浓缩液)Tris 54 g硼酸27. 5 gEDTA 2. 922 g水1 000 mL用5 mol/L的盐酸调到pH8。A. 5逆转录酶AMV的5倍浓缩缓冲液Tris一盐酸氯化钾氯化镁DTT250 mmol/L,pH8.3250 mmol/I_50 mmol/I50 mmol/LA. 6 25 mmol/L氮化镁A.7 Taq酶用10倍浓缩缓冲液Tris-HCI氯化钾TritonX-100500 mmol/L,pH8.8500 mmol/L1%A.8 EB(核酸染色荆)用水配制成10 mg/ml的浓缩液。用时每10 mL电泳液或琼脂中加1 t L,A. 9样品缓冲液每100 mL水溶液中含澳酚蓝。,25 g，蔗糖40 g,
