1、r中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1446.1-2004猪传染性胃肠炎阻断酶联免疫吸附试验Blocking ELISA for transmissible gastroenteritis of swine2004-06-01发布2004-12-01实施中华人民共和匡国家质量监督检验检疫总IFSN/T 1446.1-2004mli胃本标准的附录A为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国上海出人境检验检疫局。本标准主要起草人:李健、胡永强、王巧全、李树清。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。SN/T 1446.1-2004猪传染
2、性胃肠炎阻断酶联免疫吸附试验1范围本标准规定了猪传染性胃肠炎阻断酶联免疫吸附试验(ELISA)试验方法。本标准适用于猪传染性胃肠炎的检疫、流行病学调查、抗体水平检测以及与猪呼吸道冠状病毒(PRCV)感染的区别诊断。2仪器设备、试荆和材料2.1仪器设备普通天平、分析天平、200 FuL可调移液器、精密滴头、恒温箱、酶标仪、洗板机等。2.2试荆配制见附录A。所有化学试剂均为分析纯。2.3材料2.3.1猪传染性胃肠炎标准抗原微量板。2.3.2标准TGEV阳性对照血清、TGEV/PRCV阴性对照血清,PRCV阳性对照血清。2.3.3标准抗TGEV单克隆抗体、抗TGEV/PRCV单克隆抗体2.3.4辣根
3、过氧化物酶(HRP)标记的抗鼠IgG:商业采购，使用前对同一批号的产品进行工作浓度测定。操作程序3.、样品血清或血浆。3.2操作步骤3.2.1使用前取出所有试剂，平衡到室温(2o0C-25,C )。将反应板/条做好标记3.2.2用洗液洗板三次，每次5 min，最后一次拍干去除所有残留液体。3.2.3立即分别加人TGEV,PRCV阳性对照血清和TGEV/PRCV阴性对照血清到相应血清对照孔，100 pL/孔。具体添加见图1,3.2.4用多通道移液器添加PBST到所有样品孔，50 tL/孔。然后加人未稀释的待检血清,50 KL/孔，每份样品两孔。见图1,3.2.5密封微量板，37 0C温育2 h,
4、3.2.6按3.2. 2操作洗板3.2.7立即加人工作浓度的标准抗TGEV单克隆抗体和抗TGEV/PRCV单克隆抗体，到对应血清孔，100 pL/孔(见图1),3.2.8密封微量板，室温(200C -250C )温育30 min,3.2.9按3.2.2操作洗板。3.2. 10加入工作浓度的HRP标记抗鼠IgG.100 IL/孔，密封微量板，室温(200C-250C )温育30 min3.2. 11按3. 2. 2操作洗板。3.2. 12快速加人底物溶液，100 EaL/孔，暗盒室温(200C-250C)温育20 min左右至颜色变化。SN/T 1446.1-20043.2.13加人终止液终止反
5、应，50 pL/孔。终止液添加顺序与底物溶液添加顺序相同。颜色由蓝色转变为黄色。3.2. 14充分振荡，用酶标仪在波长450 nm处测吸光值(OD,So )，空气作为空白对照。1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12AlA2S5S5S13S13S21521S29S29537S37B1B2S6S6S14S14S22522S30S30538S38C1C2S7S7S15S15S23S23S31531S39S39DlD2S8SSS16S16S24S24532S32S40SaoS151S9S9S17S17S25S25S33S33S41S41S2S2S10S10S18S18S26S26S34S
6、34S42S42S3S3SI1S11S19S19S27S27S35S35S43S43S4S4S12S12S20S20S28S28S36S36S44S44注1; Al,A2孔为TGEV阳性对照血清添加孔，B1,B2,C1,C2为TGEV/PRCV阴性对照血清添加孔，D1,D2为PRCV阳性对照血清添加孔。注2:5为样品的英文简写注3:在操作3.2.7时，第1,3,5,7,9,11列所有血清孔加标准抗TGEV单克隆抗体，第2,4,6,8,10,12列所有血清孔加标准抗TGEV/PRCV单克隆抗体图1阻断ELISA试验样品及血清对照添加示例4结果判定4. 1数据计算4.1.1分别计算板中Bl,Cl血
7、清对照孔的平均OD43。值和B2, C2血清对照孔的平均OD45。值。4. 1.2闭值A=0. 5 X BI ,Cl血清对照孔(加TGEV单抗作用的阴性血清对照孔)的平均OI二。值。4.1.3闭值B=0. 5 X B2, C2血清对照孔(加TGEV/PRCV单抗作用的阴性血清对照孔)的平均OD,;。值。4.2有效性判断当下列条件成立时，本试验才为有效:-TGEV/PRCV阴性血清对照孔(Bl,B2,C1,C2孔)OD45。值都0. 5 ;阑值AAl孔(加TGEV单抗作用的TGEV阳性血清对照孔)OD,5。值;阑值B A2孔(加TGEV/PRCV单抗作用的TGEV阳性血清对照孔)OD45。值;阑
8、值AD2孔(加TGEV/PRCV单抗作用的PRCV阳性血清对照孔)OD,。值。4.3结果判定每份血清样品加两孔加人TGEV单抗作用的样品孔OI二。大于阂值A记为阴性“一”，小于闹值A记为阳性“+”;加人TGEV/PRCV单抗作用的样品孔OD,;。大于闭值B记为阴性“一”，小于阑值B记为阳性“+”。-TGEV抗体阳性:加TGEV单抗样品孔和加TGEV/PRCV单抗样品孔都为阳性时，判TGEV抗体阳性。-PRCV抗体阳性:加TGEV.单抗样品孔阴性，加TGEV/PRCV单抗样品孔阳性时，判PRCV抗体阳性。-TGEV和PRCV抗体阴性:加TGEV单抗样品孔和加TGEV/PRCV单抗样品孔都为阴性时
9、，判TGEV和PRCV抗体阴性。SN/T 1446.1-2004附录A(规范性附录)试荆配制洗涤液(PBST)1 PH 7. 4 0. 01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)溶液A抓化钠(NaCI)氯化钾(KCU磷酸氢二钠(Naz HP0,12H20)磷酸二氢钾(KHzPO,)蒸馏水溶液B抓化钙(CaCl22H,0)氯化镁(Mgclz6H20)蒸馏水AA40 g1g14. 5 g1g3 000 mL0. 5 g0. 5 g1 000 mL将A,B溶液分别充分溶解后，混合，用蒸馏水补充定量到5。mL，分装，121,C高压蒸汽灭菌20 min。置室温或4保存。高压后溶液可能出现白色沉淀，摇荡数次溶
10、解后使用。A. 1.2洗涤液pH 7. 4 0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS) 1 000 mL吐温-20。5 mL洗涤液保存不超过一周。A.2样品稀释液洗涤液(PBST)牛血清白蛋白(BSA)样品稀释液在4保存不能超过2d，最好每次试验随配随用。1 000 mL10gA. 3底物溶液A. 3. 1 PH 6. 0 0. 1 moi/L Z酸钠一柠檬酸缓冲液溶液A乙酸钠(CH,COONa) 8.2 g蒸馏水1 000 mL溶液B柠檬酸(HOC(COOH)(CH,COOH)zHz0) 2.1 g蒸馏水100 mL将溶液B少量逐步添加到溶液A中，每次检测pH值至6.。为止(大约需溶液B10
11、mL)。过滤或高压灭菌(1210( 20 min),40C保存。A. 3.2 TMB溶液3,3,5,5一四甲基联苯胺(3,3,5,5-Tetramethylbenzidine,TMB) 350 mg甲醇(methanol) 100 mLSN/T 1446.1-2004TMB极易见光分解，要用铝铂包裹的棕色瓶在暗室保存。冷藏环境下溶液可能出现结晶，使用前必须温育溶解。A. 3.3过妞化里(H,仇)使用商业化的30%过氧化氢(H,O,)溶液，4保存，一年左右更新.A. 3.4完整的底物溶液必须在使用之前配制。将300 HL TMB溶液加人到9. 7 mL 37平衡的乙酸钠一柠檬酸缓冲液，然后加人5 kL 30%过氧化氢(H202)溶液，将滴头洗吹数次。A. 4终止液(1 mol/L硫酸)将10 mL浓硫酸小心加人到180 mL的蒸馏水中，混匀即可。
