1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准G21 G22G21G23 G21 G22 G23 G24G22G21 G23 G24 G23动物炭疽病检疫规范G24G25 G26 G27 G26 G28 G29G2A G28 G2BG2CG27 G2D G29 G2D G2E G2D G2F G30 G2D G27 G26 G28 G2A G31 G26 G2F G26 G28 G29 G32 G27 G26 G33G21 G23 G24 G23 G34 G24 G24 G34 G23 G24发布G21 G23 G24 G24 G34 G23 G25 G34 G23 G24实施中华人民共和国国家质
2、量监督检验检疫总局发布版权所有 禁止翻制、电子发售书书书前言本标准按照给出的规则起草。本标准修改采用陆生动物诊断试验和疫苗标准手册（年）中第章制定，未采纳其中的免疫荧光及疫苗制备技术内容。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国内蒙古出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国新疆出入境检验检疫局、中华人民共和国浙江出入境检验检疫局。本标准主要起草人：王海艳、姜焱、刘虹、敖威华、刘中勇、季新成、刘中学、赵林立、张晓峰、任立新。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售动物炭疽病检疫规范范围本标准规定了动物炭
3、疽病流行病学调查、临床症状与病理学观察、细菌学检测、反应和聚合酶链反应等检疫方法。本标准适用于进出境动物炭疽病的检疫和诊断。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。实验室生物安全通用要求出口畜产品中炭疽杆菌检验方法生物安全炭疽为人畜共患病，试验环境和防护要求按照执行。培养基和试剂无菌脱纤绵羊血（或马血）。炭疽沉淀素标准抗原。炭疽沉淀素阳性血清。炭疽沉淀素阴性血清。碳酸氢钠营养琼脂平板：见附录。多粘菌素血琼脂平板：见附录。普通营养肉汤：见附录。普通营养琼脂平板：见附录
4、。戊烷脒多粘菌素琼脂平板：见附录。琼脂平板：见附录。碱性美蓝染色液：见附录。革兰氏染色液：见附录。洗样液：见附录。石炭酸生理盐水：见附录。电泳级琼脂糖粉。犜犪狇聚合酶：。（脱氧核糖核酸分子量标准）。倍浓度犜犪狇聚合酶缓冲液（犜犪狇）：氯化镁。混合物：脱氧腺苷三磷酸（）、脱氧胸苷三磷酸（）、脱氧鸟苷三磷酸（）、脱犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售氧胞苷三磷酸（）各。电泳缓冲液：见附录。加样缓冲液：见附录。溴化乙锭溶液：见附录。设备和材料恒温培养箱。二氧化碳培养箱。恒温水浴箱。生物显微镜。反应管（小试管，内直径约左右）。高压灭菌器。微量加样器。高速冷冻离心机。仪。水平凝胶电泳槽。电泳仪。凝胶成像系
5、统。临床症状依据本病流行病学调查、临床症状和病理学观察结果初步作出判定，见附录。实验室检测新鲜样品检测组织液涂片取活体动物耳部血液、病变部位的水肿液或渗出液制作涂片或取刚死亡动物末梢血制作涂片。自然干燥后，火焰固定，备用。血液琼脂平板培养取血液、水肿液、渗出物以及组织或器官切面上采集的拭子直接接种含有多粘菌素（）的马血（或羊血）血平板表面，置培养。在血液琼脂平板上，炭疽杆菌呈灰白色至灰色菌落，直径为，不溶血，表面潮湿似毛玻璃样，不透明，无光泽，边缘不整齐。用放大镜观察，边缘呈卷发状。用接种环探触有粘滞感，挑之可拉起长丝。营养肉汤培养取血液琼脂平板上的典型菌落接种营养肉汤，于培养。炭疽杆菌在肉汤
6、中生长的初期特征是肉汤上部澄清，无菌膜，下部有絮状沉淀，沉淀不易摇散。荚膜诱导培养取血液琼脂平板培养的典型菌落或营养肉汤培养物接种于含碳酸氢钠的营养琼脂平板，置犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售二氧化碳培养箱中培养，取菌落涂片，火焰固定，备用。染色镜检革兰氏染色取血液琼脂平板上的典型菌落或肉汤培养物制备涂片，火焰固定。结晶紫染色，水洗，革兰氏碘液染色，水洗，酒精脱色，水洗，沙黄复染，水洗，干燥，镜检。炭疽杆菌为革兰氏阳性菌，多个菌纵向连成长链，少数散在，菌体呈两端平齐的大杆状。有的菌体中央可见卵圆形不着色的芽孢，芽孢不使菌体膨大。荚膜染色取已固定好的血液、水肿液或渗出液、荚膜诱导培养物涂片，滴
7、加一小滴碱性美蓝染色液染色，水洗、晾干、镜检。炭疽杆菌在低倍镜下呈短链状排列，在油镜下菌体粗大呈竹节状排列，菌体呈深蓝色或黑色，菌体周围的荚膜呈粉红色。陈旧、腐败脏器、动物尸体和环境样品（包括土壤）的检测采集样品左右，将其与两倍体积的灭菌蒸馏水或去离子水混合，于水浴。然后稀释至或。取每个稀释度的样品稀释液涂布于血琼脂平板，取涂布于琼脂平板，置温箱中培养。血琼脂平板培养、琼脂平板培养。挑取可疑菌落按、的方法进行鉴定。畜产品检测细菌学检测（按照犛犖中第章、第章、和的内容执行）抽样毛绒和骨粒按生产日期或原料来源划分批次。每批按开包（箱）抽样或在扎包（装箱）时由每包（箱）各取一份样品。无菌从每包（箱）
8、的不同部位共抽样，装进灭菌的棉布袋内，将袋口扎紧，作上批次标记。将样品装入塑料袋或铁筒内，密封后送样。动物皮张应逐张取样。用灭菌棉拭子涂擦样皮的真皮面。将棉拭子插入试管，塞紧棉塞。将试管逐支用纸包裹，装入铁筒内，再用棉花或软纸填充空隙，密封后送样。样品处理毛绒和骨粒，可以根据样品多少，将适合数量的同批样品（最多不超过份）合编为一个检验样品单位，作好记录。从合编为一个检验样品单位的每个样品袋中各取样品，一起放入一个适当大小的灭菌三角瓶中。加样品量倍倍（质量浓度）的预冷洗样液于三角瓶中用灭菌瓶塞将瓶口塞严。将三角瓶冰水浴或冰箱内，间或摇动约。将瓶中洗样液倒入灭菌离心管中，盖住管口，以离心。弃去上清
9、液，加少许灭菌水，使沉淀均匀悬浮。将离心管静置，待杂质下沉后，将上悬液移入另一支灭菌试管内，于恒温水浴加热。加洗样液后的样品于热处理前如不能及时检验，应贮存于冰箱内，以防芽孢发芽。动物皮张的棉拭子涂抹样品，如不能及时检验，应贮存于冰箱内，以防芽孢发芽。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售检验方法按处理后的毛绒和骨粒样品悬液，根据每管所包括样品份数之多少，各接种个个溶菌酶多粘菌素平板或戊烷脒多粘菌素平板。接种时用灭菌吸管吸取样品，滴加于平板表面，各。如有剩余样品，可增接数个平板，直至将样品接种完。用灭菌型玻璃棒将滴加的样液涂布均匀。如样液较多，可将平板置于温箱，微开皿盖，使样液迅速干燥。翻转平皿，
10、置于恒温箱，培养。挑取可疑菌落按照、的方法进行鉴定。动物皮张的棉拭子涂抹样品，将棉拭子由试管内取出，各涂抹一个溶菌酶多粘菌素平板或戊烷脒多粘菌素平板。翻转平皿，置于恒温箱，培养。挑取可疑菌落按照、的方法进行鉴定。犃狊犮狅犾犻反应样品采集被检皮张、原毛应存放于专用仓库和指定的地方，不同批次的皮张、原毛分开存放。每批放在一处，每张皮张编号，原毛独立包装编号。在每张皮的腿部或腋下剪取样皮一块约，原毛在各独立包装取样，若无独立包装则在分散的个以上不同点各取样。样皮、样毛应装入专用的密封金属盒或耐高温防水样品袋中，并按原有号码编号。样品消毒将检验样本连同样品袋一起放入高压灭菌器，消毒。冻皮、湿皮、鲜皮应
11、在高压消毒前置室温。被检样本制备将经高压消毒的皮样去除脂肪，剪取皮样或原毛数克放到浸样瓶中，并记录样品编号和相对应的浸样瓶编号。按照质量体积的比例加入石炭酸生理盐水至浸样瓶，放冰箱浸泡后，用中性滤纸滤过浸液，其澄清液为被检样本抗原，待检。正式试验炭疽沉淀素阳性血清对照试验先将炭疽沉淀素阳性血清沿管壁徐徐加入斜置的反应管中，达到管高的三分之一处，然后吸取等量的标准炭疽抗原，沿反应管的管壁慢慢注入到沉淀素阳性血清上面（注意：不要发生气泡，不要摇动），随即将斜置的反应管立起，内判定结果。炭疽阴性血清对照试验先将炭疽沉淀素阴性血清沿管壁徐徐加入斜置的反应管中，达到管高的三分之一处，然后吸取等量的标准炭
12、疽抗原，沿反应管的管壁慢慢注入到沉淀素阳性血清上面（注意：不要发生气泡，不要摇动），随即将斜置的反应管立起，内判定结果。空白对照试验先将炭疽沉淀素阳性血清沿管壁徐徐加入斜置的反应管中，达到管高的三分之一处，然后吸取等量的石炭酸生理盐水，沿反应管的管壁慢慢注入到沉淀素阳性血清上面（注意：不要发生气泡，不要摇动），随即将斜置的反应管立起，内判定结果。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售被检样品试验准备两支反应管，将炭疽沉淀素阳性血清沿管壁徐徐加入其中一支斜置的反应管中，达到管高的三分之一处；同时按照同样方法，将炭疽沉淀素阴性血清加入另一支反应管中。将等量的被检皮毛样抗原分别徐徐加入到炭疽沉淀素阳性血
13、清反应管和阴性血清对照反应管中（注意：不要发生气泡，不要摇动），随即将斜置的反应管立起，内判定结果。结果判定结果判定如下：）炭疽沉淀素阳性血清对照试验，两液接触面出现清晰、致密如线的白色沉淀环；）炭疽阴性血清对照试验和空白对照试验，两界面无白色沉淀环出现；）被检样品试验。阴性血清对照反应管：应呈阴性反应，两界面无白色沉淀环出现。当对照试验成立时，方可判定反应结果。阴性反应：反应管中阳性血清与被检样品浸泡液间界面清晰，并且没有出现白色沉淀环。阳性反应：反应管中阳性血清与被检样品浸泡液间界面清晰，并且出现清晰、致密如线的白色沉淀环。可疑：当反应管中阳性血清与被检样品浸泡液间界面清晰，并且出现模糊、
14、疏松、不明显的白色沉淀环时，则可初步判定反应结果为可疑。出现可疑结果时，应对被检测样本进行第二次试验，第二次试验如出现阴性或阳性反应时，则可判定反应结果为阴性或阳性，如结果再次可疑，则可确定反应结果为阳性。聚合酶链反应（犘犆犚）引物序列以下引物用于证实毒素质粒和荚膜质粒的存在，引物序列见表。表犘犆犚引物序列靶基因引物序列号引物序列产物大小保护性抗原（）荚膜模板犇犖犃制备从琼脂平板上挑取新鲜炭疽杆菌菌落，加入到小离心管中，用灭菌去离子水或蒸馏水重悬，于作用，然后于冰浴中冷却至左右，离，取上清液用作反应模板。或者用市售等效提取试剂盒进行提取。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售犘犆犚扩增体系（犔）及
15、反应条件模板：。犜犪狇聚合酶（）：。犜犪狇缓冲液：。混合物（各）：。引物（或）（）：。引物（或）（）：。灭菌水：。循环参数为：预变性，变性，退火，延伸，个循环，再延伸，保温。质控对照用已知含有保护性抗原和荚膜抗原的炭疽杆菌（或用分别含有保护性抗原株和荚膜抗原的炭疽杆菌株）作为阳性对照，用非致病性的枯草芽孢杆菌或蜡样芽孢杆菌作为阴性对照，用去离子水作为空白对照，按照和的步骤进行反应。犘犆犚扩增产物的检测用电泳缓冲液配制的琼脂糖凝胶，在凝胶未凝固时加入溴化乙锭染料使其终浓度为，待胶凝固后加入扩增产物进行电泳，并用作对照。电泳完毕后用凝胶成像系统观察、记录结果。结果判断阴性对照和空白对照未扩增出目的
16、片段，阳性对照同时扩增出和目的片段，试验成立，进行结果判定。毒素质粒和荚膜质粒同时阳性的菌株为强毒炭疽杆菌，毒素质粒阳性或阴性且荚膜质粒阴性的菌株为无毒或弱毒炭疽杆菌。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售附录犃（规范性附录）培养基和试剂犃的碳酸氢钠营养琼脂平板牛肉膏蛋白胨氯化钠琼脂粉碳酸氢钠蒸馏水将以上除碳酸氢钠以外的其他各成分溶解于蒸馏水中，调至，加热煮沸溶解。于高压灭菌，待冷至时，加入经过滤除菌的碳酸氢钠溶液，混匀后倾注平板。犃多粘菌素血液琼脂平板牛肉膏蛋白胨氯化钠琼脂粉多粘菌素脱纤马血（或羊血）蒸馏水将以上除多粘菌素和脱纤马血（或羊血）以外的其他各成分溶解于蒸馏水中，调至，加热煮沸溶解。于
17、高压灭菌，待冷至时，加入多粘菌素和脱纤马血（或羊血），混匀后倾注平板。犃普通营养肉汤牛肉膏蛋白胨氯化钠蒸馏水将以上各成分溶解于蒸馏水中，调至，加热煮沸溶解。于高压灭菌。犃普通营养琼脂平板牛肉膏犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售蛋白胨氯化钠琼脂粉蒸馏水将以上各成分溶解于蒸馏水中，调至，加热煮沸溶解。于高压灭菌，待冷至时倾注平板。犃戊烷脒多粘菌素琼脂平板犃基础培养基牛肉膏蛋白胨氯化钠琼脂粉蒸馏水将以上各成分溶解于蒸馏水中，调至，加热煮沸溶解。于高压灭菌，放于恒温水浴内保温。犃戊烷脒稀释液称取戊烷脒，溶于灭菌蒸馏水中。贮存于冰箱内备用。犃多粘菌素稀释液取多粘菌素一瓶，加灭菌蒸馏水使其溶解，再用灭菌蒸
18、馏水将其稀释为。贮存于冰箱内备用。犃脱纤维羊血无菌操作采羊血，注入含有小玻璃珠的灭菌三角瓶内，立即摇动数分钟。贮存于冰箱内备用。犃完全培养基基础培养基（）戊烷脒稀释液多粘菌素稀释液脱纤维羊血犃犘犔犈犜琼脂平板心浸液琼脂溶液乙酸亚铊溶液多粘菌素犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售溶菌酶除心浸液琼脂外，其他各成分用灭菌蒸馏水配成适当贮备液，按以上量加入冷至的灭菌心浸液琼脂内，混匀后倾注平板。犃碱性美蓝染色液美蓝乙醇氢氧化钾溶液将美蓝溶解于乙醇中，再和氢氧化钾溶液混合。犃革兰氏染色液犃结晶紫染色液结晶紫乙醇草酸铵水溶液将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵水溶液混合。犃革兰氏碘液碘碘化钾蒸馏水将碘与碘化钾
19、先进行混合，加入蒸馏水少许，待完全溶解后，再加蒸馏水至。犃沙黄复染液沙黄乙醇蒸馏水将沙黄溶解于乙醇中，再加蒸馏水至。犃洗样液吐温蒸馏水将吐温加于蒸馏水中，充分搅匀，装于三角瓶内或试剂瓶内，高压灭菌。贮存于冰箱备用。犃石炭酸生理盐水将苯酚水浴溶解后，称取，溶解于的温水中，另取氯化钠溶解于少量蒸馏水加入，加至，室温保存。注：盐渍皮样浸液不加入氯化钠。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售犃犜犃犈电泳缓冲液碱冰乙酸（）将以上各成分混合，再加蒸馏水至。犃加样缓冲液氢氧化钠聚糖体（质量浓度）溴甲酚绿（质量浓度）二甲苯青（质量浓度）犃溴化乙锭溶液将溴化乙锭加入到蒸馏水中，磁力搅拌器搅拌数小时直至其完全溶解，避
20、光保存备用。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售附录犅（规范性附录）临床症状犅流行病学对当地近年来炭疽的发生情况、死于炭疽动物尸体处理情况、发病动物的种类及季节、炭疽预防接种情况等作详细调查，作为诊断依据。犅临床症状犅概述对死因不明的突然死亡病例，或临床上体表出现局限制肿胀、高热、腹痛、兴奋不安或沉郁虚弱、病情发展急剧，死后天然孔出血的病例，都应首先怀疑为炭疽。动物炭疽病至少会有三种不同的表现形式：最急性型或中风型，急性型，亚急性到慢性型。反刍动物最容易出现最急性型和急性型，马容易出现急性型，狗、猫和猪容易出现亚急性到慢性型或出现局部病变。犅最急性型在最急性型病例中，动物通常没有表现出任何症状而
21、突然死亡，有临床症状的动物，在死前不久动物体温升高至，肌肉震颤、呼吸困难、粘膜充血等。很快出现持久性痉挛、倒地、死亡。死后有时可见从天然孔流出凝固不良的血液。犅急性型牛可能出现急性型临床症状，死前可见精神沉郁、厌食、发烧、呼吸急促、心跳加快、粘膜充血、水肿等。马通常表现为急性型经过临床症状随感染部位不同而有所变化，出现肠炎和绞痛，并伴随着高热和精神沉郁，通常在发病内死亡。如果通过吸血昆虫叮咬经皮下传播，在叮咬部位出现热的结节性肿胀，并蔓延至喉、胸、腹部、阴茎包皮或乳房。喉部肿胀引起呼吸困难并使气管受到压迫。疾病经过通常为，有些动物也可存活周或更长时间。犅亚急性到慢性型家养的和野生的猪、狗和猫通
22、常出现亚急性到慢性型疾病经过，动物通常是食入了带有炭疽菌的食物而发生感染，细菌聚积在咽部淋巴结，咽部可能发生严重的肿胀，由于呼吸道堵塞而死亡。也有几天后自愈的病例。食肉动物和杂食动物也会出现严重的急性肠炎。犅病理解剖学观察在特定情况下及不扩大污染的条件下可以进行解剖。解剖时，发现尸体天然孔出血、血液凝固不良并且粘稠如煤焦油样，尸体迅速腐败，皮下和浆膜下有出血性胶样浸润，脾脏明显肿大，脾髓软化如泥等变化，可作为炭疽病的诊断依据。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售书书书犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准动物炭疽病检疫规范中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街号邮政编码：网址电话：中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本印张字数千字年月第一版年月第一次印刷印数书号：定价元版权所有 禁止翻制、电子发售
