1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖犜出口食品中致病菌环介导恒温扩增（犔犃犕犘）检测方法第部分：肺炎克雷伯氏菌犔狅狅狆犿犲犱犻犪狋犲犱犻狊狅狋犺犲狉犿犪犾犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀犱犲狋犲犮狋犻狅狀犿犲狋犺狅犱犳狅狉狆犪狋犺狅犵犲狀狊犻狀犲狓狆狅狉狋犳狅狅犱犘犪狉狋：犓犾犲犫狊犻犲犾犾犪狆狀犲狌犿狅狀犻犪犲发布实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布版权所有 禁止翻制、电子发售书书书前言出口食品中致病菌环介导恒温扩增（）检测方法共分为个部分：第部分：金黄色葡萄球菌；第部分：大肠杆菌；第部分：志贺氏菌；第部分：单核细胞增生李斯特菌；第部分：副溶血性弧菌；第部分：小肠结肠炎耶尔森氏
2、菌；第部分：空肠弯曲菌；第部分：肺炎克雷伯氏菌；第部分：溶血性链球菌；第部分：产气荚膜梭菌；第部分：产霍乱毒素的霍乱弧菌；第部分：溶藻弧菌；第部分：创伤弧菌；第部分：假结核耶尔森氏菌；第部分：阪崎肠杆菌。本部分为的第部分。本部分按照给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、广州华峰生物科技有限公司、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局、湖北出
3、入境检验检疫局检验检疫技术中心、中华人民共和国重庆出入境检验检疫局。本部分主要起草人：易敏英、王志强、高东微、李志勇、李晓虹、曹以诚、雷质文、凌莉、阳静、胡科锋、陈碧玲、郑文杰、刘津、郑晶、高旗利、陈洵、谢力、曾宪东、张霞、谭志、张体银。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售出口食品中致病菌环介导恒温扩增（犔犃犕犘）检测方法第部分：肺炎克雷伯氏菌范围的本部分规定了检测出口食品中肺炎克雷伯氏菌的环介导恒温核酸扩增（）法。本部分适用于出口食品中肺炎克雷伯氏菌的筛选检测。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版
4、本（包括所有的修改单）适用于本文件。分析实验室用水规格和试验方法实验动物肺炎克雷伯杆菌检测方法实验室生物安全通用要求实验室质量控制规范食品分子生物学检测生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测肺炎克雷伯氏菌，所有培养物和废弃物应按照中的有关规定执行。防污染措施防止污染措施应符合的规定。缩略语下列缩略语适用于本文件。：甜菜碱犅狊狋酶犅狊狋（）：犅狊狋聚合酶（大片段）（）：脱氧核糖核酸（）：脱氧核苷三磷酸（）：乙二胺四乙酸（）：环介导恒温扩增狅狆狆犃：肺炎克雷伯氏菌周质寡肽结合蛋白基因：聚乙二醇辛基苯基醚犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售技术概要根据肺炎克雷伯氏菌特有的靶序
5、列狅狆狆犃基因（参见附录）设计的两对特殊的内、外引物，特异性识别靶序列上的六个独立区域，利用犅狊狋酶启动循环链置换反应，在狅狆狆犃基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎环混合物；从析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。试剂和材料除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合中一级水的要求。引物：根据肺炎克雷伯氏菌特有的靶序列狅狆狆犃基因设计一套特异性引物，包括外引物（），外引物（），内引物（），内引物（）。外引物扩增片段长度：。（）：（）：（）：（）：缓冲液含：，氯化
6、钾，硫酸铵，硫酸镁，。：每种核苷酸浓度。甜菜碱：浓度。硫酸镁（）：浓度。犅狊狋聚合酶：酶浓度。提取液：，（）。显色液：荧光染料，。阳性对照：肺炎克雷伯氏菌标准菌株，或含目的片段的。塑料离心管。肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒），可选，参照试剂盒说明书操作。试剂盒组成及使用注意事项参见附录。）由广州华峰生物科技有限公司提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。仪器和设备移液器：量程；量程；量程。高速台式离心机：犵。水浴锅或加热模块：和。计时器。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售检测程序食品中肺炎克雷伯氏菌检测程序见图。图食品
7、中肺炎克雷伯氏菌犔犃犕犘检测程序操作步骤）采用以下方法，也可使用肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒按照说明书操作。）采用下述方法，也可使用等效的商品化的提取试剂盒并按其说明提取制备模板。样品制备、增菌培养按照的方法进行样品制备和增菌。细菌模板犇犖犃的制备）增菌液模板犇犖犃的制备对于获得的增菌液，采用如下方法制备模板：）直接取该增菌液加到无菌离心管中，犵离心，尽量吸弃上清液；）加入提取液，混匀后沸水浴，置冰上；）犵离心，上清液即为模板；取上清液置可保存个月备用。可疑菌落模板犇犖犃的制备对于分离到的可疑菌落，可直接挑取可疑菌落，再按照）步骤制备模板以待检测。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售环介导恒温核酸扩
8、增反应体系肺炎克雷伯氏菌反应体系见表。表肺炎克雷伯氏菌犔犃犕犘反应体系组分工作液浓度加样量反应体系终浓度缓冲液外引物（）外引物（）内引物（）内引物（）甜菜碱硫酸镁犅狊狋聚合酶模板去离子水反应过程按表所述配制反应体系。扩增。空白对照、阴性对照、阳性对照设置每次反应应设置阴性对照、空白对照和阳性对照。空白对照以水替代模板。阴性对照以提取液代替模板。也可使用肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒中的阴性对照。阳性对照制备：将肺炎克雷伯氏菌标准菌株接种于营养肉汤中培养，用无菌生理盐水稀释至约（约麦氏浊度），按提取模板作为反应的模板。也可使用肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒中的阳性对照。结果观察在上述反应管中加入显色液，轻轻
9、混匀并在黑色背景下观察。建议使用试剂盒专用反应管，将反应液和显色液一次性加入，扩增反应后可不必开盖即可观察结果。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售结果判定和报告在空白对照和阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下：）待检样品反应管液体呈绿色，该样品结果为肺炎克雷伯氏菌初筛阳性，对样品的增菌液或可疑纯菌落进一步按中操作步骤进行确认后报告结果；）待检样品反应管液体呈橙色则可报告肺炎克雷伯氏菌检验结果为阴性。若与上述条件不符，则本次检测结果无效，应更换试剂按本方法重新检测。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售附录犃（资料性附录）肺炎克雷伯氏菌狅狆狆犃基因序列犃肺炎克雷伯氏菌狅狆狆犃基
10、因序列（犪犮犮犲狊狊犻狅狀狀狅犆犘）注：下划线所示部分为引物扩增匹配区段。犃组成引物中碱基构成注：为连接序列。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售附录犅（资料性附录）肺炎克雷伯氏菌犔犃犕犘检测试剂盒犅试剂盒组成每个试剂盒（，每个反应体系体积为）包括以下成分：提取液；反应液；犅狊狋酶；显色液；稳定液；阳性对照；阴性对照。犅说明犅试剂盒内各试剂使用前，充分融化后稍离心。犅试剂盒内的阳性对照应视为具有污染性物质，应注意避免污染其他样品和反应试剂，导致错误检验结果。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售书书书犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口食品中致病菌环介导恒温扩增（犔犃犕犘）检测方法第部分：肺炎克雷伯氏菌中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街号邮政编码：网址电话：中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本印张字数千字年月第一版年月第一次印刷印数书号：定价元版权所有 禁止翻制、电子发售
