1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖犜进出境牛传染性胸膜肺炎检疫规程犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾狅犳犮狅狀狋犪犵犻狅狌狊犫狅狏犻狀犲狆犾犲狌狉狅狆狀犲狌犿狅狀犻犪犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋犫狅狏犻狀犲发布实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布版权所有 禁止翻制、电子发售书书书前言本标准按照给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：简中友、李叶、马贵平、史喜菊、贾赟、胡传伟、苏永生、孙颖杰。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售进出境牛传染
2、性胸膜肺炎检疫规程范围本标准规定了牛传染性胸膜肺炎（，）诊断技术要求。本标准适用于进出境牛传染性胸膜肺炎检疫、诊断及流行病学调查。术语和定义下列术语和定义适用于本文件。牛传染性胸膜肺炎犮狅狀狋犪犵犻狅狌狊犫狅狏犻狀犲狆犾犲狌狉狅狆狀犲狌犿狅狀犻犪；犆犅犘犘牛传染性胸膜肺炎（）也称牛肺疫，是由丝状支原体引起牛的一种接触性传染病，主要侵害牛的肺和胸膜，其病理特征为纤维素性或浆液纤维素性肺炎、胸膜炎。缩略语下列缩略语适用于本文件。（）：牛传染性胸膜肺炎（）：竞争酶联免疫吸附测定法（）：补体结合试验流行病学、临床及病理诊断流行病学在自然条件下，本病主要感染牛等反刍动物，如黄牛、牦牛、水牛、犏牛、奶牛，
3、其中岁岁的牛多发，犊牛少见。临床症状急性型：呈急性胸膜肺炎症状，体温升高，热型为稽留热。呼吸困难，气喘，呈腹式呼吸，频发咳嗽，流浆液性或脓性鼻液。胸部叩诊呈浊音或水平浊音，听诊肺泡音弱或消失，出现罗音、支气管呼吸音和胸膜摩擦音。后期可见胸前皮下和肉垂水肿。病牛迅速消痩，常窒息死亡。慢性型：病牛消痩，偶发干性咳嗽，胸部听诊和叩诊无明显变化。病理特点本病的特征病变主要在肺和胸腔。发病初期，多见炎性浸润，以小叶性支气管炎为特征，小叶呈灰红色局灶性充血或炎性水肿。随病程发展，多数呈典型的浆液性纤维素性胸膜肺炎、胸膜炎，一侧的膈叶和中间叶高度肿大，质度坚实如肝脏，肺肝变，常见互相镶嵌的暗红色、灰红色乃至
4、灰黄色的肝变同时存在，外观呈大理石花纹。病程较长者，病变部的肺组织发生肉变和坏死，坏死灶被结缔组织包围，进一步形成空洞或瘢痕。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售有些病例的胸腔积液呈淡黄色透明或纤维素絮状物（或絮片），严重病例发生肺与胸膜黏连。纵隔淋巴结和支气管淋巴结显著肿大，切面多汁，呈黄白色，并有坏死灶。病原分离与鉴定本试验应在生物安全级及以上实验室进行。材料准备器材：组织匀浆器、培养皿、小试管、玻片、染色缸、接种环、二氧化碳培养箱、普通显微镜。培养基和试剂：马血清马丁肉汤、普通马血清马丁琼脂、葡萄糖生化培养基、精氨酸生化培养基、四氮唑盐生化培养基、铬酸水溶液、姬姆萨氏染液，配制方法见。样品
5、采集和送检无菌采取病牛鼻腔分泌物或胸腔积液、血液和关节滑液，或剖检时采取肺脏病变组织、肺门淋巴结和胸腔渗出液，置于含运输培养基的灭菌容器中，以冷藏状态立即送实验室检疫。不能立即送检的，应置低温保存。样品处理胸腔液、血液和关节滑液可直接用作接种材料。组织样品匀浆后，用含青霉素及乙酸铊的肉汤倍稀释，置于过夜，即为接种样品液。样品接种用灭菌吸管吸取样品液，无菌接种于管马血清肉汤培养基中，培养。用无菌接种环钓取样品液在马血清肉汤琼脂平板上划线接种，每个样品接种个平板。平板用胶布封口，倒置于二氧化碳培养箱中培养。观察从接种后第开始直至第，每天观察接种管及平板生长情况。在马血清肉汤试管中，牛传染性胸膜肺炎
6、病原的生长表现为：初期呈轻微浑浊或白色点状或丝状，后逐渐均匀浑浊，呈半透明稍带乳光，无菌膜或沉淀，也无颗粒悬浮。在马血清肉汤琼脂培养基上，牛传染性胸膜肺炎病原的生长表现为：生长缓慢，为水滴状圆形略带灰色的微小菌落，中央有乳头状突起，呈“煎蛋”样外观，菌落直径约为，小的不易看见，需用放大镜或低倍显微镜观察。将可疑菌落或可疑肉汤培养物接种于马血清肉汤琼脂培养基上，培养，连传三代进行纯化，供病原鉴定用。病原鉴定培养特性挑取菌落接种于马血清肉汤培养基中，培养，牛传染性胸膜肺炎病原的生长表现如所述。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售挑取菌落接种在普通马血清肉汤琼脂培养基上，培养，牛传染性胸膜肺炎病原的生
7、长表现如所述。染色镜检挑取典型菌落，涂于玻片上，自然干燥，用铬酸水溶液固定，水洗，浸入用蒸馏水稀释的的姬姆萨氏染液中染色，过夜，取出用蒸馏水清洗，自然干燥后用倍倍显微镜观察。牛传染性胸膜肺炎病原在显微镜下表现为多形态，以球形最常见，也可见杆状、丝状、环状、星状者，长度为。生化试验挑取纯化菌落分别接种于葡萄糖生化培养基、精氨酸生化培养基和四氮唑盐生化培养基，培养后观察结果。牛传染性胸膜肺炎病原能分解葡萄糖产酸变色但不产气；不能分解精氨酸，试管不变色；能还原四氮唑盐，培养基由无色变为红色。结果判定符合、和所述条件的，判为牛传染性胸膜肺炎病原体分离鉴定阳性。微量凝集试验设备及器材微量移动液器，酶标反
8、应板或微量滴定板（微量板）等。试剂稀释液为常规方法配制的生理盐水；抗原、标准阳性血清、阴性血清按说明书使用。操作方法被检血清、标准阳性血清、阴性血清用灭菌生理盐水作稀释，灭活。用灭菌生理盐水将抗原稀释至工作浓度。吸取被检血清，加入微量板的一个孔中。加工作量抗原于同一孔内，即每头份被检血清用一个孔。每板设阴、阳性血清和生理盐水对照。轻轻摇动反应板混匀，放室温暗处或冰箱内左右。结果判定凝集程度：“”为凝集，“”为凝集，“”为凝集，“”为凝集，“”为不凝集。判定方法：判定前轻轻振动反应板，静置即行判定。判定时用日光灯照明，手持反应板，借助侧光在黑色背景上判定或用凝集反应箱观察。受检血清出现阳性反应的
9、需重复试验一次，如两次结果不一致时，应再复试一次，以两次以上试验结果一致时为准。判定标准：在阴、阳性血清和生理盐水对照成立的情况下，被检血清出现“”及以上凝集反应的判为阳性；“”和“”为阴性反应。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售补体结合试验（犆犉犜）材料准备器材玻璃试管、试管架、孔血凝板、可调式移液器、孔板离心机、水浴锅、微量振荡器。试剂巴比妥缓冲液（），配制见。牛传染性胸膜肺炎补体结合试验抗原：由世界动物卫生组织（）牛传染性胸膜肺炎参考实验室提供，使用时按说明书操作。牛传染性胸膜肺炎补体结合试验标准阴性血清、标准阳性血清：由牛传染性胸膜肺炎参考实验室提供，使用前做倍稀释，水浴灭活。溶血素：
10、兔抗绵羊红细胞（）的异源血清，冻干品，使用前进行效价滴定。补体：来自豚鼠正常血清，冻干品，使用前进行效价滴定。阿氏液：配制方法见。红细胞悬液：配制方法见。被检血清：无菌采集被检牛血液，分离血清，血清应新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，编号备用，立即送检或冰箱保存。试验前做倍稀释，水浴灭活。操作方法预备试验溶血素效价的测定补体的配制：补体加入稀释成补体，置冰浴中待用。溶血液的配制：取红细胞悬液，加入到的刻度离心管中，离心，弃上清液，加蒸馏水，混匀，使红细胞完全溶解后，再加入的氯化钠液，混匀。标准溶血管的配制：按表配制标准比色管。表标准溶血管的配制单位为毫升成分溶血度溶血液红细胞悬液溶
11、血素的配制：取溶血素原液（等量甘油保存），加入混匀制成倍稀释的溶血素。不同稀释度溶血素溶液的配制：按表用稀释的溶血素，混匀配制不同稀释度的溶血素溶液。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售表溶血素稀释表单位为毫升试管号稀释度溶血素溶血素效价确定：按表建立试验，振荡混匀，置于水浴作用，将上述各试管离心，观察结果。表溶血素效价测定单位为毫升试管号溶血素对照补体对照红细胞对照溶血素稀释度溶血素补体红细胞结果注：“”表示溶血，“”表示溶血，“”表示溶血，“”表示溶血，“”表示不溶血。溶血素对照组全部溶血，补体对照组、红细胞对照组不溶血，否则试验不成立，需重做。以溶血的溶血素的最高稀释倍数为一个单位的溶血素
12、，使用时用个单位溶血素。如表溶血素效价为，使用时应将溶血素稀释至。补体效价的测定致敏红细胞的配制：将等量的绵羊红细胞与个单位的溶血素混匀，水浴后，置于冰箱，备用。按表在冰浴中用稀释补体。表补体稀释表单位为微升试管号稀释度补体犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售按表、表、表、表建立试验，观察结果。表补体效价测定（阳性血清加抗原表）单位为毫升试管号补体稀释度补体阳性血清抗原（工作量）振荡混匀后置水浴作用致敏红细胞振荡混匀后置水浴作用，离心结果表补体效价测定（阳性血清未加抗原表）单位为毫升试管号补体对照致敏红细胞对照补体稀释度补体阳性血清振荡混匀后置水浴作用致敏红细胞振荡混匀后置水浴作用，离心结果表补
13、体效价测定（阴性血清加抗原表）单位为毫升试管号补体稀释度补体阴性血清抗原振荡混匀后置水浴作用致敏红细胞振荡混匀后置水浴作用，离心结果犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售表补体效价测定（阴性血清未加抗原表）单位为毫升试管号补体稀释度补体阴性血清振荡混匀后置水浴作用致敏红细胞振荡混匀后置水浴作用，离心结果补体效价的确定：在阳性血清加抗原管中完全不溶血，而阳性血清未加抗原管、阴性血清未加抗原管及阴性血清加抗原管中发生完全溶血的所需最小量补体即为一个单位补体。如表中一个补体单位为稀释度的补体，在正式实验中使用单位的补体。抗原效价的测定用将抗原做依次稀释。用将阳性血清做依次稀释。用将阴性血清做稀释。按表建
14、立试验。表抗原效价测定单位为毫升成分管号抗原稀释度抗原稀释度抗原稀释度抗原稀释度抗原稀释度抗原稀释度抗原稀释度血清对照抗原对照补体对照红细胞对照抗原阳性血清稀释度阴性血清单位补体缓冲液水浴作用致敏红细胞水浴作用犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售以阳性血清各稀释度发生抑制溶血最高稀释度为抗原效价，该稀释度的抗原为一个抗原单位，本试验使用个单位。正式试验对照设定：每个孔板均需设标准阴性血清、标准阳性血清、单位补体、单位补体、单位补体、致敏红细胞、抗原对照。按表建立试验，观察结果。表正式试验操作程序表单位为微升孔号样品对照致敏红细胞对照抗原对照血清被检血清阳性血清阴性血清补体对照试验孔对照孔试验孔对
15、照孔试验孔对照孔单位单位单位抗原补体振荡混匀后置水浴作用致敏红细胞振荡混匀后置水浴作用，离心结果结果判定试验成立条件阳性血清加抗原对照孔、致敏红细胞对照孔、单位补体对照孔完全不溶血；单位补体对照孔出现部分溶血；阴性血清、阳性血清对照管完全溶血，证明试验操作无误。被检血清判定被检血清的试验孔和对照孔均溶血，被检血清判为阴性。被检血清未加抗原孔溶血，被检血清加抗原孔抑制溶血，被检血清判为阳性。被检血清未加抗原孔溶血，被检血清加抗原孔出现、或抑制溶血时，被检血清判为可疑，应重新检验一次。重做时，被检血清只有出现抑制溶血才能判为阳性。被检血清对照管发生不完全溶血或完全抑制溶血时，为血清抗补体反应，此份
16、血清应重采或用其他方法测试。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售竞争酶联免疫吸附试验（犮犈犔犐犛犃）材料准备器材移液器、酶标仪、温箱、孔板、低温冷冻冰箱。试剂贮存抗原、单克隆抗体、标准阴性血清和标准阳性血清：由热带地区动物病诊断和控制合作中心提供。单克隆抗体在使用前按说明书用稀释液配制成工作浓度。贮存抗原在条件下保存。酶结合物：，由热带地区动物病诊断和控制合作中心提供，按说明书使用。包被液、稀释液、洗涤液、底物液、终止液，配制方法分别见、和。被检血清采集被检牛血液，分离血清，血清应新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，编号备用，立即送检或冰箱保存。试验前用稀释液作倍稀释。操作方法按使用说
17、明书用包被液稀释贮存抗原，包被板，孔，过夜。用洗涤液（）洗板次，孔。每孔分别加入倍稀释的被检血清和工作浓度单抗各，同时设标准阴性血清、标准阳性血清、标准弱阳性血清以及结合物对照孔、单抗对照孔，将反应板放置于温育。用洗涤液洗板次，孔。每孔加入酶结合物，反应。用洗涤液洗板次，孔。每孔加入底物液，反应。每孔加入终止液，用酶标仪在波长下读取值。结果判定样品抑制率（）计算按式（）计算样品抑制率：样品抑制率（）（犗犇犗犇样品）（犗犇犗犇）（）式中：犗犇单抗对照孔值；犗犇样品被检样品孔值；犗犇酶结合物对照孔值。试验成立的条件犗犇在之间，犗犇小于，标准阴性血清抑制率小于，标准弱阳性血清抑制率在，标准强阳性血清
18、抑制率在。试验不能同时满足上述条件，应重做。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售判定当被检样品抑制率等于或大于时，判为阳性；被检样品抑制率等于或低于为阴性；被检样品抑制率介于为可疑。可疑样品应重新试验，重新试验如样品抑制率等于或大于，判为阳性；抑制率小于时，为阴性。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售附录犃（规范性附录）培养基和试剂的配制犃运输培养基牛心浸液酵母浸膏琼脂青霉素乙酸铊马血清先将乙酸铊溶于的无菌蒸馏水中；牛心浸液中加入琼脂、酵母浸膏，煮沸溶解后，灭菌。待培养基温度降至以下时，将乙酸铊、青霉素及经灭活的马血清加入其中，混匀、分装至无菌的容器中。经无菌检验后置保存备用。犃马血清肉汤培养基牛
19、心浸液酵母浸膏马血清葡萄糖青霉素乙酸铊先将乙酸铊溶于的无菌蒸馏水中；牛心浸液中加入葡萄糖、酵母浸膏，煮沸溶解后，磅灭菌。待培养基温度降至以下时，将乙酸铊、青霉素及经灭活的马血清加入其中，混匀、分装至无菌的容器中。经无菌检验后置保存备用。犃马血清肉汤琼脂培养基牛心浸液酵母浸膏马血清葡萄糖琼脂青霉素乙酸铊先将乙酸铊溶于的无菌蒸馏水中；牛心浸液中加入琼脂、葡萄糖、酵母浸膏，煮沸溶解后，磅灭菌。待培养基温度降至以下时，将乙酸铊、青霉素及经灭活的马血清加入其中，混匀、分装至无菌的容器中。经无菌检验后置保存备用。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售犃葡萄糖生化培养基牛心浸液酵母浸膏马血清酚红葡萄糖溶液牛心浸
20、液中加入酚红和酵母浸膏，煮沸溶解，磅灭菌，无菌加入葡萄糖溶液和经灭活的马血清，混匀、分装至无菌的生化试管中。经无菌检验后置保存备用。犃精氨酸生化培养基牛心浸液酵母浸膏马血清酚红精氨酸盐溶液牛心浸液中加入酚红和酵母浸膏，煮沸溶解，磅灭菌，无菌加、无菌的精氨酸盐溶液和经灭活的马血清，混匀、分装至无菌的生化试管中。经无菌检验后置保存备用。犃四氮唑盐生化培养基牛心浸液酵母浸膏马血清酚红四氮唑盐溶液牛心浸液中加入酚红和酵母浸膏，煮沸溶解，磅灭菌，无菌加、四氮唑盐溶液和经灭活的马血清，混匀、分装至无菌的生化试管中。经无菌检验后置保存备用。犃姬姆萨氏染液取姬姆萨氏染料，加到甘油中，水浴，再加入甲醇，静止以上
21、，过滤后即成姬姆萨氏染液。犃巴比妥缓冲液（犞犅犛）氯化钠（）氯化镁（）犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售氯化钙巴比妥巴比妥钠去离子水将巴比妥加入蒸馏水内，加热溶解后再加入其他成分，溶解，加蒸馏水至，分装，高压灭菌，冷却后置冰箱保存。临用时稀释倍。犃阿氏液（犃犾狊狏犲狉狊）葡萄糖氯化钠（）柠檬酸钠柠檬酸去离子水加热溶解，过滤，分装成瓶，用高压灭菌，冷却后置冰箱保存备用。犃绵羊红细胞悬液选健康成年绵羊，无菌颈静脉采血，份阿氏液加份血液，混和后置冰箱稳定。使用时将血液吸入离心管中，离心，用吸管吸取上清液和红细胞上层的白细胞和血小板薄膜后加缓冲液洗涤，再经离心，弃去上清液，如此反复洗四次。吸取红细胞泥
22、，加的缓冲液，混匀即成绵羊红细胞悬液。犃包被液（犿狅犾犔狆犎值犘犅犛）氯化钠（）氯化钾（）磷酸二氢钾（）磷酸氢二钠（）水加蒸馏水溶解至，高压灭菌，冷却后置冰箱备用。犃稀释液值马血清吐温混匀后置冰箱备用。犃洗涤液（犠犅）值吐温犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售混匀后置冰箱备用。犃底物液磷酸二氢钠（）柠檬酸，（）双氧水水犃终止液（犿狅犾犔硫酸）量取浓硫酸，加入水，混匀。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售书书书犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准进出境牛传染性胸膜肺炎检疫规程中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街号邮政编码：网址电话：中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本印张字数千字年月第一版年月第一次印刷印数书号：定价元版权所有 禁止翻制、电子发售
