1、ICS 65. 150 B 51 中华人民共和国国家标准GB 20556-2006 三疵梭子蟹Swimming crab 2006-09-29发布2006-12-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局也世中国国家标准化管理委员会战叩中华人民共和国国家标准三梭于蟹GB 20556-2006 9舍中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销争夺开本880X 1230 1/16 印张O.75 字数18千字2006年12月第一版2006年12月第一次印刷* 书号:155066
2、1-28674 定价10.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533G 20556-2006 前言本标准的5.1和5.2为强制性条款，其余为推荐性条款。本标准的附录A、附录B为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国水产标准化技术委员会海水养殖分技术委员会归口。本标准起草单位t中国水产科学研究院黄海水产研究所、中国海洋大学、山东省油业技术推广站。本标准主要起草人:张岩、于东祥、陈四清、孔晓瑜、李鲁晶、王春生。I GB 20556-2006 =挠梭子蟹1 范围本标准给出了三疵梭子蟹CPortunustritubeculatus Mi
3、ers)的主要形态构造特征、生长与繁殖特征、生化遗传学特征、分子生物学遗传特征以及检删方法。本标准适用于三疵梭子蟹的种质鉴2 术语和定义2. 1 2.2 下列术语和定义适用全甲宽full 成体型三疵梭甲宽成体型三3. 1 学名三疵梭子甲壳纲(三疵梭子蟹质潮间带海滩广等，这些地方都形性。养在池塘中的工倾斜倒垂于水中，第5的交角，仅露出眼及触角，梭子蟹属于杂食性动物，烂的水生植物。而且不同生长通常白天摄食量少，傍晚和夜间5 形态特征5. 1 外形时，常与池底呈阳。450:水藻嫩芽，海生动物尸体以及腐于杂食性，个体愈大愈趋向肉食性。和32.C以上时，梭子蟹停止摄食。头胸甲呈棱形，背面大部为茶绿色，后
4、缘和后侧缘呈紫色，并有灰白色斑点分布，腹面均为灰白色;整足发达，长节呈棱柱形，内缘具钝齿，整足背面紫色，具灰白色斑点;前3对步足蓝色，指节紫色。第4对步足掌节和指节扁平、宽薄;背面除指节外具灰白色斑点;腹部扁平，雄蟹腹部呈三角形，雌蟹呈圆形。三班梭子蟹的外部形态见图1。1 GB 20556-2006 5.2 可勤性状电疆酝_，J.且学)?14FL 户，仿幡r( 固1三捷梭子蟹外形5.2. 1 头胸甲表面有3个显著的疵状隆起，1个在胃区，2个在心区。5.2.2 头胸甲两前侧缘各具9个锯状齿，第9齿特别长大。5.2.3 额缘具2枚-6枚小齿，一般4枚;前侧缘斜拱形，长于后侧缘。5.2.4 额部两侧
5、有1对能转动的带柄复眼。5.2.5 胸足5对。5.3 可盟性状成体型三疵梭子蟹的甲宽与全甲宽的关系见式(1)、式(2):雄蟹:W=0.0801XL-0.120雌蟹:W=0.0793XL0.029式中1W一一甲宽，单位为毫米(mm); L一一全甲宽，单位为毫米(mm)。6 生长与繁踵6: 1 生长6. 1. 1 生长. ( 1 ) .( 2 ) 三疵梭子蟹幼蟹以后每次蜕皮的体重增长如图2所示，每蜕皮一次约增重2.8倍。在越年(两年)养成中，经过2次-3次蜕皮，甲宽达18cm以上，体重最大可超过1kgo 2 国、250 200 g m 100 50 为蜕皮经过天数/天圄2三挠梭子蟹的生长6. 1.
6、 2 不同蜕皮龄期与全甲宽及温童的关系不同蜕皮龄期与全甲宽及湿重的关系见表10表1三班梭于蟹不同蜕皮龄期与全甲宽及混重的关系蜕皮龄期全甲宽/湿重/蜕皮龄期口1mg C1 4.00 C9 C2 6.30 C10 C3 7.30 C11 C4 12.00 C12 C5 16.50 C13 C6 21. 50 C14 C7 30.00 1. 5 C15 C8 40. 50 3. 7 C16 注.C为幼蟹或成体蟹，C1为1蜕皮龄蟹，其他类推。6. 1. 3 金用宽与体囊(湿重)的关系三ffl;梭子蟹全甲宽与体重(温重)关系式以式(3)表示:w = 0.058 8V 式中zW一一体重(湿章)，单位为克(
7、g);L一一全甲宽，单位为厘米(cm)。6.2 繁殖6. 2. 1 性成熟年龄全甲宽/m盯153.50 58. 50 90.00 110.00 133.00 155.00 180.00 203.00 GB 20556-2006 湿重/g 8.50 18.00 45.00 90.00 155.00 235.00 355.00 500.00 . ( 3 ) 三疵梭子蟹雌雄异体。雌性和雄性个体，均在其成体型的第12龄期或第13龄期达到性成熟。6.2.2 生物学最小型野生三疵梭子蟹雌、雄蟹的生物学最小型均为全甲宽13cm。6.2.3 性腺发育周期雄蟹在当年秋季性腺发育成熟，并与雌蟹交尾，雌蟹性腺从当年
8、的秋季开始发育，到第二年的春季发育成熟产卵。三疵梭子蟹进行多次产卵，一般产卵两次，大型雄蟹可连续产卵3次4次，个别可达5次。春季孵化出的幼蟹生长速度很快，当年体重长到150g左右即可达到性成熟，成为补充群体。冬眠后的雌蟹来年产卵后，可继续蜕壳生长，第三年还可产卵繁殖。雄蟹在第二年越冬捆游前大量死亡。6.2.4 产卵噩三班梭子蟹一次产卵的数量，同亲蟹的大小大体成正比，为80X104粒450X104粒，同一雌蟹的抱卵数，第二批和第三批次均小于第一批次，例如，全甲宽为20cm的雌蟹，至产出第三批次的年产卵量，约为600X 104粒.，660X 104粒(见图3)。3 GB 20556-2006 40
9、0 nU内n内Uqd肉，榈树民领砾凉100 14 16 18 20 22 24 全甲宽/cm国3三挠梭子蟹的抱卵量6.2.5 繁疆7.1温在渤海，7月是越年蟹交配的盛期，春夏之交是梭子蟹的繁殖季节，三疵梭子蟹的产卵活动集中分布于括海河口附近。4月下旬底层水温升至14C -26C时开始产卵，在我国沿海产卵期由南向北向后推移。7 生化遗传学特征7. 1 主要同工酶的情型三疵梭子蟹肌肉中超氧化物歧化酶(SOD)、磷酸葡萄糖变位酶CPGM)、腺昔酸激酶(AK)同工酶的电拉图谱分别见图4、图5和阁6。固4三班梭子蟹SOD电谏圄i曾(单态)图5三re梭子蟹PGM电珠圈谱(多态)固6王梭子蟹AK电珠圈i蕾(
10、多态)7.2 生化遗传特征采用水平淀粉凝胶电咏技术，对40个三疵梭子蟹进行了同工酶分析。在11种同工酶中共检测到了23个基因位点。根据PO95多态位点判别标准，多态位点比例为14.7%;根据标准计算，平均杂合度观察值(Ho)为0.086士0.018;平均杂合度期望值为(H.)0.103士O.011 ;平均有效等位基因数(N.)为1. 375土0.117GB 20556-2006 8 分子遗传学特征采用PCR技术、分子克隆技术及DNA序列测定技术，对三疵梭子蟹的钱粒体168rRNA(核糖体168 rRNA)基因片段进行了PCR扩增(引物序列见检测方法)和序列测定，获得了长度为566bp的核昔酸序
11、列。168 rRNA基因片段序列t1 CCGGTCTGAA CTCAGATCAC GTAAAAAATT AAAGGTCGAA CAGACCTTCT TATATAGCTG 61 CTGCACTATA AAGACATTTT AATTCAACAT CGAGGTCGCA AACTTATTCT TTGATAAGGA 121 CTCTCAGAAT 181 GATCAACTAA 241 TTATACTTTT 301 TATAAAATTT 361 GCCTTTTCAC 421 ACCATTCATA 481 ATACCGCGGC 541 9 检测方法9. 1 繁踵力的测定用天平或杆秤式中zG一一产卵量ml一一产
12、卵前m2一一产卵后m样l一一试样ln2一一试样2的卵m刷一一试样l质量，9.2 生化遗传学特征的9.2. 1 样晶处理测定AAATTACGCT 样本活体低温保存带回实将部分组织(约0.5g)取出放入(pH7. 0) ,0. 1 mol!L磷酸缓冲破的配中抽提0.5h,. l h，然后在OOC，.40C冷冻离心机咏样品。9.2.2 电球分析ATCTTTTAAT CCCTTTCAGG TTTCTAGCAG TTATTAATAA TAAAAAAATA AAATATCTAA TCTTTGTCCA CACGGTCAAG TACCCTCTAA 刚产出. ( 4 ) 一760C)或液氮罐中贮存。)的O.1
13、mol/L磷酸缓冲液，倒入1.5 mL离心管内，40C冰箱r/min离心10min，离心后的上清液作为电采用水平淀粉凝肢电泳方法，凝胶浓度为12%，TC制胶缓冲液见附录A。电$缓冲系统为TC电极缓冲液(pH7.0) , TC电极缓冲液的配置见附录A，恒流(电流大小为12mA)电$12h。电掠过程在40C冰箱中进行。凝胶厚度为6mm，电泳后切成4片，.5片，分别进行各种酶的染色，染色过程在370C恒温箱中进行，同工酶染色液的配制见附录B。9.2.3 数据处理数据处理见式(5)、式(的、式(7)和式(8)。5 GB 20556-2006 多态位点比例(P)= (多态位点数/所测位点总数)x 100
14、% . . . ( 5 ) 平均杂合度观察值(Ho)=多态位点杂合度观察值之和/观察位点总和. . . ( 6 ) 平均杂合度期望值(H.)=多态位点杂合度期望值之和/观察位点总和. . . ( 7 ) 平均有效等位基因数(N.)= (N.i)/n (其中N.i= 1-Hoi) . . . ( 8 ) 9.3 分子遗传学特征的测定9.3.1 DNA提取取肌肉组织，尽量剪碎，用DNA提取试剂盒或常规酣方法提取基因组DNA，TE溶解后一20.C保存备用，TE搭液的配置见附录A.9.3.2 PCR扩增16SrRNA引物(l6sAR/BR)序列为:5-GCCTGTTTATCAAAAACAT-3 (l6
15、sAR); 5-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3 06sBR)。25L PCR扩增反应体积内含:2.0mmol/L MgClz ,0. 2 mmol/L每种dNTP，0.2mo1/L每种引物，1LDNA模板，1UTaq酶及1X缓冲液。PCR反应程序为:94.C预变性2min;94.C 45 s , 50.C 1 min , 72.C 1 min，循环35次;最后72.C延伸5 min. PCR产物1.4%琼脂糖凝肢电掠，EB染色，凝胶成像系统观察、照相。9.3.3 PCR产物克隆PCR产物经回收纯化后，连接到T载体上。连接反应体积10L，其中载体1L，连接酶15L，PCR产物4
16、L，16.C连接1h或4.C过夜，然后连接液转化感受态大肠杆菌，涂平板，蓝-白斑筛选阳性，克隆，液体培养基培养，提纯质粒后用EcoRI和HindIll酶切检测有无插入片段。9.3.4 序列测定对回收质粒进行测序反应，产物纯化后在DNA测序仪上测序;为保证测序的可靠性和准确性，采用双向测序，并进行人工核对、校正。10 判定规则检测结果不符合5.1和5.2要求的，则判定为不合格项;有不合格项的样品为不合格样品。6 A. 1 O. 1 mol/L磷酸援冲液(pH7.0)附景A规范性附录)握冲撞的配置GB 20556-2006 0.01 mol/L磷酸氢二饷榕液57.7mL, O. 01 mol/L磷
17、酸二氢铀榕液42.3mL，加水至1000 mL , pH7. O. A.2 TC制肢摄冲液三起甲基氨基甲:境3.028g，用拧撵酸调pH至7.0.蒸锢71.定容至1L.A.3 TC电极摆;中被三捏甲基氨基甲:皖42.65g，用拧撵酸i周pH至7.0.蒸锢7.k定容至10L Q A.4 TE援冲液(pH8.0)10 mmol/L Tris-HCICpH8. 0) ,1 mmol/L EDTACpH8. 0)。USN-mmONmu 附录(规范性附录)同工酶染色渣的配置B GB 20556一2006表B.l给出了各同工酶染色液的成分。表B.1 同工酶染色液的配制同工酶英文名和缩写试剂浓度用量Tris
18、-HCl 0.2 mol!L,pH8. 5 15 mL . 超氧化物Suprroxide desmutase MTT(幢幢蓝)0.5% 0.5 mL 歧化酶(SOD) PMS(吩嚓甲醋硫酸盐)0.5% 0.5 mL 琼脂1. 0% 10 mL Tris-HCl 0.2 mol!L，pH8.。15 mL NADP(辅酶100.25% 0.5 mL MgClz 1. 0 mOl!L 0.1 mL .G6PD 6U 磷酸葡萄糖Phosphoglucomu-tase (。磷酸葡萄糖脱氢酶)变位酶(PGM) Glucose-1-phosphate 13 mg (1幅磷酸葡萄糖)MTT(喔峨蓝0.5% 0
19、.5 mL PMS(盼嚓甲醋硫酸盐)0.5% 0.5 mL 琼脂1. 0% 10 mL Tris-HCl 0.2 mol!L,pH8. 0 15 mL NADP(辅酶ll)0.25% 0.5 mL MgCIz 1. 0 mol/L 0.25 mL 葡萄糖O. 1 g-O. 2 g ADP(二磷酸腺昔)14 mg-20 mg 腺管酸Adenylate Kinase 激酶(AK) G6PD 12U (6-磷酸葡萄糖脱氢酶)己糖激酶1. 5 mg-3 mg MTT(喽略蓝)0.5% 0.5 mL PMS(吩嚓甲醋硫酸盐)0.5% 0.5 mL 琼旨1. 0% 10 mL 侵权必究A哇田四phvm oo-0,-1AE . nhVM nnv嗣AUm p气uwhUM 唱EA-:-2 号一价书一定Jl.j 10.00 * 版权专有
