1、ICS 65.020.01 B 04 备案号： 61229-2019 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1517 2018 从红豆草中提取纯化缩合单宁的方法 Method for Extraction and Purification of Condensed Tannins from Sainfoin(Onobrychis viciifolia Scop.) 2018-12-20发布 2019-03-20实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 1517 2018 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定
2、义 . 1 4 材料与试剂 . 2 5 仪器与设备 . 2 6 材料的准备 . 3 7 溶液的配制 . 3 8 缩合单宁的提取 . 3 9 缩合单宁的纯化 . 3 10 注意事项 . 4 DB15/T 1517 2018 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由内蒙古自治区农牧业科学院提出。 本标准由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（ SAM/TC19）归口。 本标准起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院兽医研究所、中国农业科学院草原研究所。 本标准起草人：刘秀丽、侯勇跃、李锋、裴乐、李元恒、卢岩、阿木古楞。 DB15/T 1517 2018 1 从红豆草
3、中提取纯化缩合单宁的方法 1 范围 本标准规定了红豆草中缩合单宁提取和纯化的方法。 本标准适用于实验室研究和提取阶段的中型试验。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 15686 高粱 单宁含量的测定 3 术语和定义 下列术语定义适用于本文 件。 3.1 单宁 tannins 又称 单宁酸、 鞣酸，是植物 以碳为基础的复杂酚类 次生代谢产物， 分子量在 500 3000 Da。 普遍存 在于植
4、物茎，叶，树皮，花和种子的细胞壁和液泡之中。 3.2 缩合单宁 condensed tannin， CT 又称 原 花青素，是由黄烷 -3-醇通过碳 -碳双键连接构成的缩合物。 3.3 提取 extraction 选择适当的溶剂 和 方法将所要的 目标 成分溶解出来，并同原材料分离的过程。本方法是利用相似相 溶原理通过有机溶液浸提法将红豆草中缩合单宁分离出来。 3.4 纯化 purification 利用凝 聚过滤法根据分子筛原理按分子物质大小进行分离。 DB15/T 1517 2018 2 3.5 凝胶活化 gel activation 干燥的商品凝胶颗粒 ， 使用前在欲使用的洗脱液中进行浸
5、泡溶胀。 3.6 凝胶过滤 gel filtration 利用凝胶的三维网状结构分子筛的过滤作用 ， 将化合物按分子量大小不同进行分离。 4 材料与试剂 4.1 材料 红豆草（ Onobrychis viciifolia Scop.） ：红豆草所含缩合单宁主要集中于叶片内且随着红豆草 物候期的成熟缩合单宁含量逐渐下降，建议采集 孕蕾期 的 红豆草 材料，人工齐地刈割， 适量 置于保温箱 内 。 4.2 试剂 4.2.1 除非另有说明，在方法中使用的试剂均为分析纯，实验室用水应符合 GB/T 6682中三级水的要 求。 4.2.2 丙酮。 4.2.3 无水乙醇。 4.2.4 抗坏血酸。 4.2.
6、5 乙醚。 4.2.6 葡聚糖凝胶 Sephadex LH-20（吸水率为 2.5 mL/g） 。 5 仪器与 设备 5.1 旋转蒸发仪（转速范围 20 280 rpm，温度范围室温 5 180 ）。 5.2 真空冷冻干燥机（冷阱温度能达到 -50 左右，建设采用仪器 FreeZone 2.5 liter freeze dry systems, LABCONCO）。 5.3 氮气吹干仪（水浴式，温度范围室温 5 100 ）。 5.4 磁力搅拌器（转速范围在 0 1000 rpm）。 5.5 天平（精度为 0.01 g， 0.0001 g）。 5.6 旋涡混浊仪。 5.7 高速冷冻离心机（温度
7、4 ）。 5.8 水浴锅（温度范围室温 5 100 ）。 5.9 粉碎机（筛子孔径 1 mm）。 5.10 可调移液器（ 0.5 mL 5 mL， 1 mL 10 mL）。 5.11 真空泵。 5.12 布氏漏斗（ 200 mL，直径 90 mm，带磨口三角瓶，且带真空泵接口）。 5.13 聚乙烯离心管（ 5 mL、 50 mL）。 DB15/T 1517 2018 3 6 材料的准备 将采集的红豆草样品， 用剪刀 剪碎约 1 5 cm长 的小段，放于带孔的保鲜袋内， 置于 -50 的 真 空 冷冻干燥机 内 冻干，取出后再用 可控孔径（ 1 mm） 粉碎机粉碎成粉末 ， 置于避光处，备用。
8、7 溶液的配制 7.1 70 %丙酮溶液 准确量 取丙酮 700 mL加水定容到 1000 mL，摇匀，即为 1 L 70%丙酮溶液。 7.2 50 %丙酮溶液 准确量 取丙酮 500 mL加水定容到 1000 mL，摇匀，即为 1 L 50%丙酮溶液。 7.3 提取溶液 称取 1 g抗坏血酸，加入到 1 L 70%丙酮溶液内，溶解后 的 终浓度为 0.1%，即为提取溶液。 7.4 80 %乙醇溶液 准确量 取无水乙醇 800 mL加水定容到 1000 mL，摇匀，即为 1L 80%乙醇溶 液。 8 缩合单宁的提取 称取 50 g红豆草样品置于 1 L提取溶液（见 7.3）中，置于避光处，放在
9、磁力搅拌器上搅拌抽提 1 h 后，将抽提物 于 4 下以 1000 g离心 15 min，倒出上清液，沉淀再重复提取一次，合并两次上清液， 加入等量（约 1500 mL）乙醚 ， 混合均匀， 于 室温（ 20 25 ）静置 5 min；待分层（若不出现分层， 再加乙醚直到分层）后，弃去上层有机溶液，保存下层水相溶液。将水相部分经旋转蒸发仪（ 120 rpm， 40 ）减压蒸发浓缩。若减压蒸发不能完全去除丙酮，可再经氮气吹干仪（ 40 ） 吹扫，充分去除液 相中的丙酮后，置 真空冷 冻干 燥 机冻干，冻干粉即为红豆草缩合单宁的粗提物，颜色为淡棕黄色，置棕 色瓶中， 于 -20 下 保存。 9 缩
10、合单宁的纯化 9.1 凝胶活化 称取 200 g葡聚糖凝胶 Sephadex LH-20干粉用 700 mL 80%乙醇浸泡， 用玻璃搅拌棒 充分缓慢搅拌， 用封口膜密封，室温放置 24 h或过夜后，倾倒掉 80%乙醇，再用 80%乙醇浸泡 1 2 h进行平衡后， 再 转移 到布氏漏斗里 ，待用 。 9.2 凝胶过滤 取上述 8中所得 缩合 单宁提 取 物冻干粉末，加入 200 mL 80%乙醇溶解，并用滤纸过滤。将滤过液转 移到 装有活化凝胶的 布氏漏斗里，真空缓慢抽滤。待全部溶液滤完，用 80%乙醇反复冲洗柱子除去杂质， 待到滤液颜色逐渐变浅到无色，弃去所有滤液。再用 50%丙酮水溶液进行洗脱， 反复 操作直到滤液颜色 为无色，合并所有的滤液，将滤液经旋转蒸发仪（ 120 rpm， 40 ）浓缩，再经氮气吹干仪（ 40 ） DB15/T 1517 2018 4 充分去除液相中的丙酮后，置 真空冷 冻干 燥 机冻干，冻干粉即为红豆草缩合单宁纯品，颜色为淡黄色， 置棕色瓶中， 于 -20 下 保存。 10 注意事项 葡聚糖凝胶 LH-20可反复使用 。 每次用完， 应 用 80%的乙醇洗 3 5遍，并用 80%的乙醇浸泡在烧 杯或 广口瓶中， 溶胀凝胶占到总体积的 75%为宜， 封好口， 4 贮存，备用；在纯化过程中，柱子不能抽干， 始终保持湿润。 _
