DB15 T 968-2016 玉米秸秆低温高效降解复合菌系筛选方法.pdf

1、ICS 65.020.20 B 05 备案号： 49427-2016 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 968 2016 玉米秸秆低温高效降解复合菌系筛选方法 2016 - 03 - 15 发布 2016 - 06 - 15 实施 内蒙古自治区质量技术监督局 发布 DB15/T 968 2016 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由内蒙古农业大学提出 。 本标准归口单位：内蒙古农业大学。 本标准起草单位：内蒙古农业大学 。 本标准主 要起草人： 高聚林 、 于晓芳 、 王振 、 王志刚 、 闹干朝鲁 、 胡树平 、 孙继颖

2、 、 谢岷 、 苏治军 、 青格尔 。 DB15/T 968 2016 1 玉米秸秆低温高效降解复合菌系筛选方法 1 范围 本 标准规定了 玉米秸秆低温高效降解复合菌系 的筛选过程。 本标准适用于在 4 15 条件下玉米秸秆降解微生物的筛选。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验 室 用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列 术语 和 定义适用于本 文件 。 3.1 纤维素酶 cellulases 在各种酶组分的协同作用下

3、，能降解纤维素，使之变成纤维寡糖、纤维二糖和葡萄糖的酶。 3.2 纤维素酶活 性 cellulase activity 1 min 释放 1 mol 葡萄糖所需酶量为一个单位（ U/mL 或 U/g）。 3.3 滤纸酶活 性 filter paper activity 1 g固体酶或 1mL液体酶，在温度 50 0.1 ，在指定 pH条件下（酸性纤维素酶 pH 4.8，中性纤 维素酶 pH 6.0），水解滤纸底物 1 h，产生出相当于 1 mg葡萄糖的 还原糖量，为 1个酶活单位，以 U/g或 U/mL表示 。 3.4 内切 - -1,4-葡聚糖酶活 性 endoglucanases 1 g固

4、体酶或 mL液体酶，在温度 50 0.1 ，在 指 定 pH条件下（酸性纤维素酶 pH 4.8，中性纤维 素酶 pH 6.0），水解羧甲基纤维素钠底物 1 h，产生出相当于 1 mg葡萄糖的还原糖量，为 1个酶活单位， 以 U/g或 U/mL表示。 3.5 外切 - -1,4-葡聚糖酶活 性 cellobiohydrolases DB15/ T 968 2016 2 1 g固体酶或 1 mL液体酶，在温度 50 0.1 ，在 指 定 pH条件下（酸性纤维 素酶 pH 4.8，中性纤 维素酶 pH 6.0），水解脱脂棉底物 1 h，产生出相当于 1 mg葡萄糖的还原糖量，为 1个酶活单位，以 U

5、/g 或 U/mL表示。 3.6 -葡萄糖苷酶 活 性 -glucosidase 1 g固体酶或 mL液体酶，在温度 50 0.1 ，在 指 定 pH条件下（酸性纤维素酶 pH 4.8，中性纤维 素酶 pH 6.0），水解水杨苷底物 1 h，产生出相当于 1 mg葡萄糖的还原糖量，为 1个酶活单位，以 U/g或 U/mL表示。 4 缩略语 下列缩略语适合本文件。 FPA：滤纸酶活性 (Filter paper activity)。 Cx：内切 - -1,4-葡聚糖酶活性 (Endoglucanases)。 C1：外切 - -1,4-葡聚糖酶活 性 (Cellobiohydrolases)。 C

6、B： -葡萄糖苷酶活 性 ( -glucosidase)。 5 筛选程序 5.1 菌源样品的采集 选择 寒冷地区 ，采集 富含纤维素的土壤或牛羊粪样品 ，每个样品采集量约 1 kg。 5.2 富集培养 将 10 %菌源样品接种到富集培养基 之一中（见附录 A） 进行富集培养；培养 15 d 20 d 至富集培 养基颜色变深、滤纸条或玉米秸秆溃烂，取培养液，按 5 % 10 %接种 量接种到新鲜的富集培养基中继 续富集培养，如此转接富集培养 4 次 5 次 。 5.3 继代培养 取富集培养后的培养液 ， 按 5 % 10 %接种量接种到放置有滤纸条的继代培养基中 （见附录 A） ， 在 25 条

7、件下， 继代培养至滤纸条黄化断裂时，记录断裂 时间，并吸取断裂处培养液 ， 转接至新的继代 培养基中，如此连续重复继代培养 5 次 。 5.4 低温驯化培养 在 25 条件下， 继代培养至滤纸条黄化断裂时间恒定时，按每传一代降低 1 的温度梯度进行低 温驯化，驯化 培养 温度至 4 时停止。 在驯化过程中 选择滤纸分解情况好的培养物 。 5.5 产酶培养 按 5 % 10 %接种量 吸取低温驯化 后的培养液 ， 接种到产酶培养基中， 在 10 条件下 培养 12 d， 每隔 24 h 测定纤维素酶活 性 。 5.6 玉米 秸秆降解培养 DB15/T 968 2016 3 按 5 % 10 %接

8、种量 吸 取 低温驯化 后的培养液，接种到玉米秸秆降解培养基中， 在 10 条件下 培 养 15 d 后 ，测定秸秆降解率。 5.7 玉米秸秆低温高效降解复合菌系初筛 通过产酶试验选择保留滤纸酶活 性 高于 0.5（ U/g 或 U/mL）和内切 - -1,4-葡聚糖酶活 性 、外切 - -1,4-葡聚糖酶活 性 、 -葡萄糖苷酶 活 性 高于 1.0（ U/g 或 U/mL）的菌系，淘汰酶活 性 较低的菌系。 （酶活性测定方法 见附录 B） 6 玉米秸秆低温高效 降解菌系筛选指标 玉米秸秆低温高效 降解微生物筛选指标见表 1。 表 1 玉米秸秆降解微生物筛选指标 项目 数值范围 滤纸酶活 性

9、 （ U/g 或 U/mL） 0.5 内切 - -1,4-葡聚糖酶活 性 （ U/g 或 U/mL） 1.0 外切 - -1,4-葡聚糖酶活 性 （ U/g 或 U/mL） 1.0 -葡萄糖苷酶 活性 （ U/g 或 U/mL） 1.0 秸秆降解率 （ %） 20 % 注 ： 以上项目均为最高酶活 性 和降解率 DB15/ T 968 2016 4 A A 附 录 A （规范性附录） 筛选 复合细菌 系 的试验材料 A.1 仪器 设备 恒温培养箱 、 恒温摇床 、 超净工作台 、 酸度计 （ 精确值 0.01）、 高压蒸汽灭菌锅 、 电子天平 (精确 值 0.001 g)、 恒温干燥箱 、 离

10、心机 、 磁力搅拌器 (附加热功能 )、 恒温水浴锅 、 分光光度计 、 移液器 (精 度为 1 L) A.2 试剂和材料 本标准使用的试剂均为分析纯，水均为符合 GB T 6682 中规定的二级水。 无离子水、无菌水、蒸馏水 、 滤纸条 、 酒石酸钾钠 (C4H4KNaO64H 2O)、 苯酚 、 亚硫酸钠 氢氧化钠溶液 (200 g L)：称取氢氧化钠 20.0 g，加 100 mL 水溶解。 柠檬酸溶液 (0.1 mol L)：称取 柠檬酸 (C6H8O7H 2O) 2.10 g，加水溶解定容至 100 mL。 柠檬酸钠溶液 (0.1 mol L)：称取柠檬酸钠 (Na3C6H5O72H

11、 2O) 2.94 g，加水溶解定容至 100 mL。 pH 值 4.8， 0.l mol/L 的柠檬酸 -柠檬酸钠缓冲液： 0.l mol/L 的柠檬酸 40 mL 与 0.l mol/L 的柠檬 酸三钠 60.0 mL 混合。 DNS 试剂：称取 3， 5-二硝基水杨酸 3.15 g，加水 500 mL 搅拌溶解，水浴至 45 ，然后逐步加入 氢氧化钠溶液 100 mL，同时不断搅拌，直至完全溶解，再逐 步加入酒石酸钾钠 91.0 g、苯酚 2.50 g 和亚硫酸钠 2.50 g，搅拌至溶解，冷却到室温后，定容至 1000 mL。过滤，取滤液贮存于棕色瓶中，避 光保存。室温下存放 7 d

12、后可以使用，有效期为 6 个月。 注 ： 处理酸碱 和配制 DNS 试剂时，应在 通风橱或通风良好的房间进行，戴上保护眼镜和乳胶手套，一旦皮肤或眼睛 接触了上述物质，及时用大量的水冲洗。 葡萄糖标准溶液 (1 mg/ mL)：精确称取 105 烘至恒重的无水葡萄糖 (分析纯 )1.000 g，用蒸馏水 溶解后，定容至 1000 mL 容量瓶中备用。 Whatman 1 号滤纸条：称取 50 mg0.1 mg(1.0 cm6.0 cm) 滤纸备用。 脱脂棉：称取 50 mg0.1 mg 脱脂棉备用。 1 %羧甲基纤维素钠底物溶液： 1 g 羧甲基纤维素钠加热溶于 100 mL pH 值 4.8，

13、 0.l mol/L 的柠檬 酸 -柠 檬酸钠缓冲液中。 0.5 %水杨苷溶液： 0.5 g 水杨苷加热溶于 100 mL pH 值 4.8， 0.l mol/L 的柠檬酸 -柠 檬酸钠缓冲 液中。 A.3 培养基 A.3.1 富集培养基 A.3.1.1 富集培养基 1 硫酸铵 2.0 g/L。 磷酸氢二钾 1.0 g/L。 DB15/T 968 2016 5 七 水硫酸镁 0.05 g/L。 碳酸钙 2.0 g/L。 氯化钠 0.2 g/L。 滤纸条 1 cm10 cm。 玉米秸秆 5 g/L(1 cm 2 cm 茎秆 )。 无菌水 1 L。 A.3.1.2 富集培养基 2 蛋白胨 5 g/

14、L。 酵母提取粉 1 g/L。 氯化钠 5 g/L。 玉米秸秆 5 g/L(1 cm 2 cm 茎秆 )。 滤纸条 1 cm10 cm。 无菌水 1 L。 A.3.2 继代培养基 硫酸铵 2.0 g/L。 磷酸氢二钾 1.0 g/L。 七水硫酸镁 0.0 5g/L。 碳酸钙 2.0 g/L。 氯化钠 0.2 g/L。 玉米 秸秆 5 g/L(1 cm 2 cm 茎秆 )。 无菌水 1 L。 A.3.3 产酶培养基 蛋白胨 0.5 g/L。 硫酸铵 2.0 g/L。 磷酸氢二钾 1.0 g/L。 尿素 0.6 g/L。 七水硫酸镁 0.05 g/L。 七水硫酸锰 0.016 g/L。 七水硫酸锌

15、 0.017 g/L。 氯化钙 0.02 g/L。 氯化钠 0.2 g/L。 无菌水 1 L。 A.3.4 玉米秸秆降解培养基 玉米秸秆 50 g/L(1 cm 2 cm 茎秆 )。 硫酸铵 15 g/L。 尿素 3 g/L。 蛋白胨 3 g/L。 氯化钙 0.1 g/L。 七水硫酸镁 5 g/L。 DB15/ T 968 2016 6 磷酸 氢二钾 1 g/L。 氯化钠 0.1 g/L。 七水硫酸铁 0.05 g/L。 七水硫酸锰 0.016 g/L。 七水硫酸锌 0.014 g/L。 氯化钴 0.02 g/L。 无菌水 1 L。 DB15/T 968 2016 7 B B 附 录 B （规

16、范性附录） 复合菌系降解效果测定方法 B.1 复合菌系纤维素酶活 性 测定 B.1.1 样品的制备 B.1.1.1 液体样品 取 2 mL 5 mL 液体样品，于 4 、 6000 rpm/min 离心 10 min，上清液即为粗酶液。 B.1.1.2 固体样品 称取 0.1 g 1.0 g 样品，加入 10 mL 无菌水，磁力搅拌 30 min，于 4 、 6000 rpm/min 离心 10 min， 上清液即为粗酶液 。 B.1.2 葡萄糖标准曲线绘制 取 9 支刻度试管，分别吸取 1 mg/mL 葡萄糖溶液 0、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0、 1.2、 1.4 和

17、1.6 mL 于刻度试管中，之后分别加入蒸馏水 2.0、 1.8、 1.6、 1.4、 1.2、 1.0、 0.8、 0.6 和 0.4 mL，再向 各试管中加入 3.0 mL 3,5-二硝基水杨酸（ DNS）试剂摇匀后，沸水浴 10 min，立即用流动水冷却后移 至 25 mL 容量瓶中，加蒸馏水定容。混匀后，以空白溶液调零， 540 nm 测 OD 值。以葡萄糖浓度为横坐 标， OD 值 为纵坐标绘制标准曲线。 表 B.1 葡萄糖标准曲线绘制 编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 葡萄糖溶液 mg/mL 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 蒸馏水 2.0

18、 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 DNS 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 共计 5 吸光值 B.1.3 滤纸酶活 性 （ FPA）测定方法 取 4 支 25 mL 试管，测定管加 0.2 mL 酶液和 pH=4.8 的柠檬酸钠缓冲液 1.8 mL，空白管加高温灭 活的酶液 0.2 mL 和 pH=4.8 的柠檬酸钠缓冲液 1.8 mL。以上试管中均加入 1 cm6 cm 滤纸条，充分浸 泡后同时置 （ 50 0.5 ） 恒温水浴 60 min；然后加入 DNS 显色液 3 mL，沸水浴 10 min，冷却后 移至 25 m

19、L 容量瓶中，加蒸馏水定容。以空白调零， 540 nm 测 OD 值。重复 4 次。 DB15/ T 968 2016 8 B.1.4 内切 -1,4-葡聚糖酶活 性 （ Cx）测定 取 4 支 25 mL 试管 ，测定管加 0.2 mL 酶液和 1.8 mL 羧甲基纤维素（质量分数 1 %），空白管加高 温灭活的酶液 0.2 mL 和 pH=4.8 的柠檬酸钠缓冲液 1.8 mL。随后置 (50 0.5 ) 恒温水浴锅 30 min 后分别加入 DNS 显色液 3 mL，沸水浴 10 min，冷却后移至 25 mL 容量瓶中，加蒸馏水定容。以空白溶 液调零， 540 nm 测 OD 值。重复

20、 4 次。 B.1.5 外切 -1,4-葡聚糖酶活 性 （ C1）测定 取 4 支 25 mL 试管，测定管加 0.2 mL 酶液和 pH =4.88 的柠檬酸钠缓冲液 1.8 mL，空白管只加 pH=4.8 的柠檬酸钠缓冲液 1.8 mL。各管中加入 50mg脱脂棉，充分浸泡后同时置 (50 0.5 ) 恒温水浴 60 min； 然后加入 DNS 显色液 3 mL，沸水浴 10 min，冷却后移至 25 mL 容量瓶中，加蒸馏水定容。以空白调零， 540 nm 测 OD 值。重复 4 次。 B.1.6 -葡萄糖苷酶活 性 （ CB）测定 取 4 支 25 mL 试管，测定管加 0.2 mL

21、酶液和 1.8 mL 水杨苷（质量分数 0.5 %），空白管加高温灭 活的酶液 0.2 mL 和 pH=4.8 的柠檬酸钠缓冲液 1.8 mL。随后置 (50 0.5 ) 恒温水浴锅 30 min 后， 分别加入 DNS 显色液 3 mL，沸水浴 10 min，冷却后移至 25 mL 容量瓶中，加蒸馏水定容。以空白溶液 调零， 540 nm 测 OD 值。重复 4 次。 B.2 计算方法 B.2.1 纤维素酶活 性 计算 X=A/(M t)1000 n （ B.1） 式中 ： X 表示纤 维素酶活 性 ， 1 min 释放 1 mol 葡萄糖所需酶量为一个单位 （ U/mL 或 U/g） ； A 根据标 准曲线方程计算而得的对应 葡萄糖的质量，单位为 毫克（ mg） ； M 葡萄糖的 摩尔质 量， 单位为 180.2 克每摩尔（ 180.2 g/moL）； T 酶解反应 时间，单 位为 分钟（ min） ； 1000 转化 因子， 1 毫摩尔 (mmol)=1000 微摩尔 ( moL)； n 粗酶液 的稀释倍数 。 B.2.2 秸秆降解率 计算 D=（ W0-W1） /W0100% （ B.2） 式中 ： D 秸秆降解率 (%)； W0 接种前 培养基中的秸秆重 ，单位为克 （ g） ； W1 培 养结束烘干后降解剩余 秸秆 物重 ，单位为克 （ g） 。